Fortschritte bei der Messung der Orientierung von fluoreszierenden Molekülen

Das Messen, wie fluoreszierende Moleküle ausgerichtet sind, kann wichtige Informationen über Strukturen und Aktivitäten in der Biologie und Materialwissenschaft liefern. Indem ein fluoreszierender Marker an ein biologisches Sample angebracht wird, das mit der Struktur mitgeht, können Wissenschaftler durch die Ausrichtung des Markers etwas über sein Verhalten herausfinden. Viele Fluoreszierende Marker leuchten auf eine bestimmte Art und Weise, wenn sie von Licht angeregt werden, sodass Forscher spezielle Mikroskope nutzen können, um zu sehen, wie sich das Lichtmuster ändert. Das kann ihnen helfen, die Ausrichtung der Marker zu verstehen.

Es gibt mehrere Techniken, die Messungen in kleinen Bereichen ermöglichen, die durch die Grösse des verwendeten Lichts limitiert sind. Indem viele Messungen des selben Punkts mit unterschiedlichen Lichteinstellungen gemacht werden, können Forscher die Ausrichtung der fluoreszierenden Marker berechnen. Das hat geholfen, verschiedene biologische Phänomene wie Zellmembranen, Protein-Dynamik und unterschiedliche Materialien zu studieren.

Kürzlich haben neue Methoden es Wissenschaftlern ermöglicht, Messungen von einzelnen Molekülen durchzuführen. Diese Techniken können jetzt mehr Informationen liefern, einschliesslich der Position und Ausrichtung von Molekülen, was wertvoll ist, um Dinge wie die Formveränderung von DNA unter Stress oder das Verhalten bestimmter Proteine zu studieren. Allerdings haben diese Methoden Einschränkungen in Bezug auf die Geschwindigkeit, mit der sie Messungen durchführen können, und die Arten von Markern, die verwendet werden können.

Nach der Untersuchung der verfügbaren Techniken wurde eine Lücke in der Fähigkeit gefunden, sowohl die Ausrichtung als auch die Position von Gruppen von fluoreszierenden Markern zu messen. Ein neues System namens Dual-View-Lichtblatt-System wurde vorgeschlagen. Diese Anordnung hat zwei Arme zum Anregen und Detektieren von Licht, was abwechslungsreichere Beleuchtung und bessere Auflösung beim Betrachten von Proben ermöglicht.

#Verwendung von Flüssigkristall-Polarisatoren

In den ersten Tests wurden Flüssigkristall-Polarisatoren zu beiden Armen dieses neuen Lichtblatt-Systems hinzugefügt, um zu sehen, wie die Ausrichtung der fluoreszierenden Marker in kleinen Bereichen gemessen werden kann. Allerdings erwies sich die Kombination der Daten von einzelnen Molekülen mit den traditionellen Methoden für Gruppen von Molekülen als schwierig. Ein neuer Ansatz, inspiriert von einer bestehenden Imaging-Technik namens Diffusions-Tensor-Magnetresonanztomographie, wurde entwickelt, um die dreidimensionale Ausrichtung der fluoreszierenden Marker effektiver zu messen.

Diese neue Methode konzentrierte sich darauf, eine Orientierungsverteilungsfunktion zu verwenden, die eine Möglichkeit darstellt, die Ausrichtung der Marker darzustellen und zu analysieren. Sie ermöglichte es Wissenschaftlern, Probleme mit den Messungen zu identifizieren und eine Lösung zu finden, die als Lichtblatt-Neigung bezeichnet wird. Diese Anpassung verbesserte die Fähigkeit, Ausrichtungsambiguitäten zu lösen. Nachfolgende Ergebnisse zeigten verschiedene Strukturen in Zellen, einschliesslich Membranen und Protein-Komplexen.

#Verständnis von Orientierungsverteilungsfunktionen (ODFs)

Orientierungsverteilungsfunktionen (ODFs) dienen als Modelle zur Darstellung, wie fluoreszierende Marker in einem bestimmten Bereich ausgerichtet sind. Bei vielen gängigen Markern ist es sinnvoll anzunehmen, dass ihre Absorptions- und Emissionsmuster auf eine einzelne Achse vereinfacht werden können. Indem alle Marker innerhalb eines kleinen Bereichs zusammengefasst werden, können Forscher die ODF als sphärische Funktion visualisieren, wobei die Grösse der Kugel die Anzahl der Marker repräsentiert, die in jede Richtung ausgerichtet sind.

Fluoreszierende Marker können während der Messung rotieren, was zu Änderungen in den ODFs führt. Die Art und Weise, wie diese Marker angeregt werden und Licht emittieren, bedeutet, dass ihre Muster immer symmetrisch sind. Daher können ODFs effektiv verwendet werden, um das Verhalten von Gruppen von Markern innerhalb biologischer Strukturen zu modellieren.

Verschiedene Formen von ODFs können verschiedene Verhaltensweisen von fluoreszierenden Markern darstellen. Zum Beispiel zeigen Marker, die sich frei drehen können, eine sphärische ODF, während solche, die an einer Oberfläche gebunden sind, andere Formen annehmen. Das Verständnis dieser ODFs ist entscheidend für die Interpretation, wie fluoreszierende Marker in unterschiedlichen Umgebungen agieren.

#Dual-View-Anregung und -Detektion

In diesem Abschnitt wird das Setup des Dual-View-Lichtblatt-Systems erklärt. Dieses System besteht aus zwei Wasserimmersion-Linsen, die sowohl Licht anregen als auch detektieren können. Durch die Verwendung dieser Linsen können die Forscher unterschiedliche Anregungsmuster erstellen, um die Proben zu untersuchen. Die Möglichkeit, zwischen verschiedenen Beleuchtungseinstellungen zu wechseln, erlaubt eine gezielte Anregung spezifischer Marker in der Probe.

Die Verwendung sphärischer harmonischer Zerlegungen ermöglicht es den Forschern, ODFs zu simulieren und zu analysieren, um deren Designs besser zu verstehen. Die Simulationen zeigen, wie ODFs in einfachere Komponenten zerlegt werden können, was hilft, Schlussfolgerungen über die untersuchten Proben zu ziehen.

Das Imaging-System ermöglicht verbesserte Messungen und kann viele Informationen über die 3D-Ausrichtungen von fluoreszierenden Markern erfassen. Die Daten können auf verschiedene Arten visualisiert werden, einschliesslich der Anzeige, wo die meisten Marker ausgerichtet sind oder der Dichte der Marker in unterschiedlichen Bereichen.

#Überwindung der Messherausforderungen mit Lichtblatt-Neigung

Während des Imaging-Prozesses stellte sich heraus, dass bestimmte Winkelkomponenten der Daten fehlten, was zu Schwierigkeiten führte, alle Ausrichtungen wiederherzustellen. Durch das Hinzufügen von Neigungsmöglichkeiten zum Lichtblatt-System konnten Wissenschaftler dasselbe Probengebiet beleuchten und gleichzeitig neue Winkelinformationen erschliessen.

Diese Änderung hilft, einen besseren Kontrast zu erzeugen und mehr Ausrichtungen zu beleuchten, was ein vollständigeres Verständnis dafür ermöglicht, wie Marker dreidimensional ausgerichtet sind. Forscher fanden heraus, dass die Verwendung einer Kombination verschiedener Messungen mit den geneigten Lichtblättern ihre Fähigkeit verbessert hat, die Formen der ODFs aufzulösen und die Ausrichtungen genau zu messen.

Das neue Setup wurde validiert, indem riesige unilamellare Vesikel (GUVs) untersucht wurden, und es zeigte, dass fluoreszierende Marker wie erwartet ausgerichtet waren. Die Fähigkeit, frühere Messprobleme zu korrigieren, verdeutlichte die Vorteile des Neigungsansatzes und führte zu genaueren Ergebnissen.

#Validierung mit biologischen Proben

Nachdem festgestellt wurde, dass die Lichtblatt-Neigung die Rekonstruktion der Ausrichtung verbessert hat, wurde die Methode verwendet, um verschiedene biologische Proben zu untersuchen. Das System wurde mit GUVs, Pflanzen-Xylem und Actin-Proteinen in Zellen getestet.

Bei den GUV-Tests wurden die ODFs und Spitzenausrichtungen analysiert, wobei gezeigt wurde, dass die Marker konsequent von der Oberfläche weg zeigten, wie vorhergesagt. Die Setups erwiesen sich als fähig, subtile Änderungen in der Ausrichtung zu erkennen.

Bei der Untersuchung von Xylemzellen spiegelten die ODFs die erwarteten Ausrichtungen von Cellulose-Strukturen wider und bestätigten das vorherige Wissen aus Studien, die sich auf zweidimensionale Beobachtungen konzentrierten. Die Messungen demonstrierten die Genauigkeit des Systems und die Fähigkeit, neue Einblicke in dreidimensionale Strukturen zu enthüllen.

Zuletzt wurden Actin-Proteine in U2OS-Zellen analysiert, um deren Ausrichtungen zu kartieren. Die Ergebnisse bestätigten die erwartete Ausrichtung der Actin-Filamente entlang ihrer langen Achsen und zeigten die Effektivität des Systems bei der Visualisierung komplexer Strukturen in drei Dimensionen.

#Untersuchung des Zellverhaltens auf Nanodrähten

Das System wurde weiter verwendet, um Maus-Fibroblasten zu untersuchen, die auf Nanodraht-Arrays gezüchtet wurden. Dieses Setup hilft, zu untersuchen, wie Zellen mit ihrer Umgebung interagieren.

Bilder zeigten, dass Actin-Filamente sich mit den nächstgelegenen Nanodrähten ausrichteten, was es Wissenschaftlern ermöglichte, das lokale Zellverhalten zu erforschen. Die rekonstruierten Modelle zeigten unterschiedliche Populationen von Actin-Ausrichtungen und wurden verwendet, um Metriken abzuleiten, die veranschaulichen, wie diese Filamente mit ihrer lokalen Umgebung interagierten.

Forscher verglichen Ergebnisse aus verschiedenen Nanodraht-Anordnungen und fanden heraus, dass die Actin-Ausrichtungen signifikant je nach Substrat variieren. Die Daten zeigten eine Korrelation zwischen dem lokalen Verhalten der Actin-Filamente und der allgemeinen Form der Zellen, was Einblicke gibt, wie die Zellarchitektur mit der zugrunde liegenden extrazellulären Matrix zusammenhängt.

#Schlussbemerkungen

Die Fortschritte beim Messen der Ausrichtungen von fluoreszierenden Molekülen haben eine Brücke zwischen zweidimensionalen Studien und dreidimensionalen Erkenntnissen geschlagen. Die Einführung von Techniken wie Orientierungsverteilungsfunktionen hat verfeinert, wie Wissenschaftler Daten von fluoreszierenden Markern analysieren. Das Dual-View-Lichtblatt-System, das durch Lichtblatt-Neigung verbessert wurde, hat präzisere Messungen ermöglicht, was zu neuen Entdeckungen über biologische Strukturen geführt hat.

Es gibt immer noch Potenzial für Verbesserungen in diesen Imaging-Systemen, insbesondere in Bezug auf die Erhöhung der Messgeschwindigkeit und die Verbesserung der Einheitlichkeit der Reaktionen. Künftige Arbeiten könnten neue fluoreszierende Marker einführen und zeitauflösende Messungen erkunden, um das dynamische Verhalten komplexer biologischer Systeme besser zu verstehen.

Insgesamt hat die Arbeit die Möglichkeiten zum Studium der molekularen Ausrichtungen erweitert und es Forschern ermöglicht, ein tieferes Verständnis biologischer Phänomene und Materialien in drei Dimensionen zu erlangen.