Verbesserung der Bildgebungstechniken mit dual-markierten DNA-Strängen

Fluorophor-markierte DNA-Stränge sind wichtige Werkzeuge in fortgeschrittenen Mikroskopie-Techniken. Diese kleinen Stränge helfen Wissenschaftlern, winzige Dinge, wie Strukturen in Zellen, klarer zu sehen. Wenn sie mit speziellen Bildgebungsverfahren kombiniert werden, ermöglichen sie bessere Bilder von biologischen Proben.

#Schlüsseltechniken

Einige der fortgeschrittenen Mikroskopie-Techniken, die diese DNA-Stränge nutzen, sind:

• Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM): Diese Methode hilft, den Standort einzelner Moleküle in einer Probe zu identifizieren.
• DNA Points Accumulation in Nanoscale Topography (DNA-PAINT): Diese Technik verwendet kurze DNA-Stränge, um detaillierte Bilder von Strukturen zu erstellen.
• Super-Resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI): Diese Methode liefert hochauflösende Bilder, indem sie die Fluktuationen von Licht analysiert.
• Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie: Diese Technik bietet Superauflösungsbilder, indem sie ein spezielles Lichtmuster verwendet, um Hintergrundsignale auszuschalten.

Ein grosser Vorteil der Verwendung dieser DNA-Stränge ist ihre Fähigkeit, mehrere Ziele gleichzeitig zu markieren. Indem verschiedene markierte Stränge gewaschen und wieder hinzugefügt werden, können Wissenschaftler wiederholte Bilder machen, die helfen, ein vollständigeres Bild der Probe zu erstellen.

#Bildoptimierung mit DNA-Labels

Ein spezieller Vorteil von DNA-PAINT ist, dass Wissenschaftler messen können, wie viel von einem bestimmten Molekül vorhanden ist. Das kann durch einen Prozess namens kinetische Analyse erfolgen. Allerdings können schwach-affine DNA-Labels zu Herausforderungen führen. Diese Labels müssen während der Experimente in der Bildgebungs-Pufferlösung bleiben, was das Hintergrundrauschen erhöhen und die Bildakquisition verlangsamen kann.

Um dieses Problem anzugehen, haben Wissenschaftler FRET-quenched Fluorophore eingeführt. Das sind spezielle Arten von Fluorophoren, die in Verbindung mit längeren DNA-Strängen das Hintergrundrauschen reduzieren können. Kürzlich haben Wissenschaftler gezeigt, dass die Verwendung von DNA-Strängen an beiden Enden mit identischen Fluorophoren zu Selbstquenching führen kann. Das bedeutet, dass die Stränge, wenn sie nicht an ihr Ziel gebunden sind, eine geringere Fluoreszenz zeigen, was zu klareren Bildern führt.

#Charakterisierung neuer Sonden

Wissenschaftler haben mehrere neue fluorophor-markierte DNA-Stränge entworfen, die als "Imager-Stränge" bekannt sind. Sie verwendeten eine gängige DNA-Sequenz und hängten Fluorophore an die Enden oder nur an ein Ende. Die in dieser Studie ausgewählten Fluorophore waren Cy3B, Silicon-Rhodamin (SiR) und Tetramethylrhodamin (TMR).

Sie charakterisierten diese Stränge, indem sie ihr Verhalten in Lösung untersuchten, wenn sie allein waren und wenn sie an einen komplementären Strang gebunden waren. Indem sie die Absorption und Fluoreszenzeigenschaften betrachteten, konnten sie sehen, wie effektiv diese neuen Stränge waren.

#Beobachtungen

Wenn die Imager-Stränge zwei Fluorophore tragen, ändern sich ihre fluoreszenten Signale, wenn sie frei in Lösung sind im Vergleich dazu, wenn sie an ein Ziel gebunden sind. Insbesondere steigt das Fluoreszenzsignal signifikant beim Binden, was darauf hinweist, dass die doppelt markierten Stränge effektiv für das Imaging sind.

Sie beobachteten auch Veränderungen in der Geschwindigkeit, mit der die Stränge an ihre Ziele binden und sich wieder lösen, was hilft zu bestimmen, wie lange sie während des Imaging anhängen bleiben.

#Anwendung in der STED-Mikroskopie

Die neuen doppelt markierten Imager-Stränge wurden in der STED-Mikroskopie getestet, wo man hoffte, dass sie das Hintergrundfluoreszenzlicht von ungebundenen Sonden reduzieren würden. Frühere Ergebnisse zeigten, dass bestimmte Kombinationen von doppelt markierten Strängen effektiv das Hintergrundrauschen reduzierten und gleichzeitig die Helligkeit der gebundenen Sonden erhöhten.

Die erhaltenen Bilder zeigten, dass einige Stränge zwar eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beim Binden aufwiesen, alle doppelt markierten Stränge jedoch im Vergleich zu ihren einfach markierten Gegenstücken geringere Hintergrundsignale zeigten. Das führte zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis für jeden verwendeten doppelt markierten Strang im Imaging.

Ausserdem war die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses mit einer verbesserten Bildauflösung verbunden. Diese Verbesserung bedeutet, dass Wissenschaftler kleinere Details in ihren Proben unterscheiden konnten.

#Zwei-Farben-Imaging

Durch die Nutzung von doppelt markierten Strängen konnten Wissenschaftler auch simultanes Zwei-Farben-Imaging durchführen. Das bedeutet, dass sie zwei verschiedene Strukturen in einem einzigen Experiment visualisieren konnten, was noch reichhaltigere Informationen über die untersuchte Biologie liefert.

#Fortschritte in der DNA-PAINT-Mikroskopie

Die Wissenschaftler wandten diese doppelt markierten Imager-Stränge auch in der DNA-PAINT-Mikroskopie an. Sie konzentrierten sich auf Cy3B und SiR, die für ihre Stabilität und spektrale Trennung bekannt sind. Durch den Vergleich der Leistung von einfach markierten und doppelt markierten Strängen in DNA-Origami-Strukturen konnten sie beurteilen, wie gut diese Stränge zusammenwirkten.

Die Ergebnisse zeigten, dass doppelt markierte Stränge verbesserte Fluoreszenzeigenschaften boten, was zu besseren Imaging-Ergebnissen führte. Der Anstieg der Photonenausbeute war signifikant, und doppelt markierte Stränge lieferten eine verbesserte Auflösung.

#Visualisierung biologischer Strukturen

Mit den doppelt markierten Imager-Strängen visualisierten die Wissenschaftler wichtige Strukturen wie das nukleare Porenkomplexprotein Nup96. Sie verglichen die Photonenausbeute von einfach und doppelt markierten Strängen und bestätigten, dass doppelt markierte Stränge mehr Photonen lieferten und bessere Bilddetails bereitstellten.

#Fazit

Diese Forschung zeigt, wie Selbstquenching-Dimere, die an kurze DNA-Stränge gebunden sind, das Imaging in fortgeschrittenen Mikroskopie-Techniken erheblich verbessern können. Durch die Nutzung von doppelt markierten DNA-Sonden können Wissenschaftler höhere Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse und verbesserte Bildauflösungen erreichen.

Die Implikationen dieser Arbeit gehen über nur einen Bereich der Mikroskopie hinaus. Die Prinzipien, die diesen doppelt markierten Strängen zugrunde liegen, könnten für andere Techniken adaptiert werden, was zu weiteren Fortschritten in der biologischen Bildgebung führen könnte. Letztendlich eröffnet diese Forschung die Tür zu präziseren Beobachtungen biologischer Prozesse und Strukturen auf molekularer Ebene.