Fortschritte in der Gentechnik von Kautschukbäumen
Forschung untersucht CRISPR-Techniken, um den Ertrag und die Qualität von Gummibäumen zu verbessern.
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Inhaltsverzeichnis
Kautschukbäume, wissenschaftlich bekannt als Hevea brasiliensis, sind richtig wichtig für die Herstellung von natürlichem Gummi, der in verschiedenen Branchen gebraucht wird. Da die Nachfrage nach natürlichem Gummi weltweit steigt, müssen die Erträge und die Qualität des produzierten Gummis verbessert werden. Das ist nötig, um den unterschiedlichen Bedürfnissen der verschiedenen Märkte, einschliesslich der Industrie- und Verteidigungssektoren, gerecht zu werden.
Herausforderungen im Anbau von Kautschukbäumen
Kautschukbäume sind mehrjährige Pflanzen, die normalerweise 5-6 Jahre brauchen, um zu blühen und Samen zu produzieren. Diese lange Wartezeit kann ein echtes Problem für Landwirte und die Gummiindustrie sein. Ausserdem haben Kautschukbäume eine komplexe Genetik, was bedeutet, dass ihre Blüh- und Samenproduktionsraten stark von Umweltfaktoren abhängen können. In Ländern wie China sind diese Herausforderungen oft noch stärker ausgeprägt, was die Gesamtproduktivität des Kautschukanbaus beeinträchtigt.
Derzeit werden neue Kautschukbaumvarietäten hauptsächlich durch Züchtungstechniken entwickelt, bei denen zwei Elternpflanzen gekreuzt werden. Allerdings führt diese Methode oft zu Nachkommen mit unerwünschten Eigenschaften, was die Möglichkeit für den grossflächigen Anbau neuer Sorten einschränkt. Die meisten der verwendeten Elternpflanzen stammen aus einem begrenzten genetischen Pool, was die genetische Vielfalt verringert, die nötig ist, um die Erträge der Kautschukbäume effektiv zu steigern.
Wegen dieser Herausforderungen hat die Züchtung von Kautschukbäumen in den letzten Jahrzehnten keine nennenswerten Fortschritte gemacht. Diese Stagnation hat einen dringenden Bedarf an innovativen Techniken, einschliesslich Gentechnik, erzeugt, um schneller als mit traditionellen Züchtungsmethoden neue und verbesserte Kautschukbaumvarietäten zu schaffen.
Das Versprechen der Gentechnik
Eine der vielversprechendsten Techniken in der Gentechnik ist CRISPR/Cas9. Diese Technologie ermöglicht es Wissenschaftlern, das genetische Material von Pflanzen zu bearbeiten, um gewünschte Eigenschaften zu verbessern oder unerwünschte zu unterdrücken. Während CRISPR bereits erfolgreich in vielen anderen Pflanzenarten eingesetzt wurde, hinkt die Forschung an Kautschukbäumen hinterher. Frühere Versuche, CRISPR auf Kautschukbäume anzuwenden, erzielten nur begrenzte Erfolge, hauptsächlich aufgrund von Schwierigkeiten bei der Transformation der Baumzellen.
Das grösste Hindernis für effektives genetisches Editing bei Kautschukbäumen war bisher das unreife Transformationssystem. Historisch gesehen verwendeten Wissenschaftler eine Agrobacterium-vermittelte Transformation, bei der neue Gene in die Zellen der Pflanze eingeführt wurden. Obwohl einige Kautschukbaumsetzlinge mit dieser Technik produziert wurden, waren die Erfolgsraten aufgrund verschiedener Faktoren, einschliesslich suboptimaler Wachstumsbedingungen für die Zellen, niedrig.
In jüngsten Bemühungen haben Wissenschaftler somatische Embryonen als effektivere Option für die Transformation in Betracht gezogen. Somatische Embryonen sind eine Art Pflanzenzelle, die sich zu einer vollständigen Pflanze entwickeln kann, ohne den typischen Samenbildungsprozess zu durchlaufen. Sie haben das Potenzial, die Transformationseffizienz zu verbessern.
Verbesserung der Transformationstechniken
Um die Transformationsraten der Kautschukbaumzellen zu erhöhen, haben Forscher daran gearbeitet, verschiedene Faktoren zu optimieren, einschliesslich der Wahl der Antibiotika, die zur Auswahl der transformierten Zellen verwendet werden. Antibiotika sind entscheidend, um die Zellen zu identifizieren, die erfolgreich neues genetisches Material integriert haben. Frühere Studien zeigten, dass Kanamycin häufig verwendet wurde, aber negative Auswirkungen auf das Wachstum der somatischen Embryonen hatte.
In dieser Studie testeten die Wissenschaftler verschiedene Antibiotika und fanden heraus, dass Hygromycin die effektivste Wahl war. Durch die Implementierung einer kontinuierlichen Selektionsstrategie mit Hygromycin erreichten sie ein besseres Gleichgewicht bei der Transformation der Zellen, während sie deren Wachstum und Entwicklung unterstützten.
Erzeugung editierter Kautschukbaumsetzlinge
Die Forscher induzierten erfolgreich Embryonen, die das Editiergen aufgenommen hatten. Sie schnitten diese Embryonen in kleinere Abschnitte und unterzogen sie einer weiteren Runde der Embryogenese. Dieser Prozess führte zur Produktion vieler neuer Embryonen, die Anzeichen einer erfolgreichen genetischen Bearbeitung zeigten.
Insgesamt wurden 33 neue Embryogenerationen produziert, und weitere genetische Tests bestätigten, dass fast die Hälfte von ihnen homozygot war, was bedeutet, dass sie zwei identische Kopien des bearbeiteten Gens hatten. Das war eine bedeutende Verbesserung gegenüber früheren Versuchen.
Sichtbare Eigenschaften bei Kautschukbäumen erreichen
Aus den bearbeiteten Embryonen wurden mehrere Setzlinge regeneriert. Unter ihnen zeigten einige einzigartige Eigenschaften. Besonders auffällig war, dass einige Pflanzen einen albino Phänotyp aufwiesen, was auf eine erfolgreiche Bearbeitung des Gens hinweist, das für die Chlorophyllproduktion verantwortlich ist. Durch die Sequenzierung der Genome dieser Pflanzen bestätigten die Forscher, dass die Genbearbeitung zu homozygoten Mutationen führte.
Die Forschung zeigte nicht nur die Fähigkeit, genetisch bearbeitete Kautschukbäume zu produzieren, sondern hob auch das Potenzial hervor, dass diese bearbeiteten Pflanzen ihre Eigenschaften an die nächste Generation weitergeben können, ohne weitere Modifikationen.
Herausforderungen und Ausblick
Obwohl die Studie beeindruckende Ergebnisse erzielte, bleiben Herausforderungen bestehen. Viele der anfänglich transformierten Embryonen waren chimerisch, was bedeutet, dass sie aus einer Mischung von bearbeiteten und nicht bearbeiteten Zellen bestanden. Diese Komplexität erschwert es, vollständig transformierte Pflanzen zu identifizieren.
Das Forschungsteam stellte fest, dass obwohl ein hoher Anteil an T-DNA-Integration beobachtet wurde, die meisten nicht die gewünschten Bearbeitungen in den Genen ergaben. Das weist darauf hin, dass eine weitere Optimierung der verwendeten Genbearbeitungsvektoren und der Bedingungen, unter denen die Transformationen stattfinden, nötig ist.
Um diese Probleme anzugehen, planen die Forscher, die genetischen Vektoren, die in zukünftigen Experimenten verwendet werden, zu modifizieren. Sie möchten die aktuellen Promotoren, die die Editiergene steuern, durch stärkere, effizientere ersetzen, die sich in anderen Pflanzenarten bewährt haben. Mit diesen Anpassungen erwarten sie eine höhere Bearbeitungseffizienz und eine grössere Anzahl stabiler, homozygoter Pflanzen.
Fazit
Diese Studie stellt einen bedeutenden Fortschritt bei der Verbesserung der Züchtung von Kautschukbäumen durch Gentechnik dar. Durch die Optimierung der Transformationstechniken und die erfolgreiche Erzeugung bearbeiteter Setzlinge haben die Forscher den Weg für die zukünftige Nutzung der CRISPR-Technologie zur genetischen Verbesserung von Kautschukbäumen geebnet. Während das Team weiterhin seine Methoden verfeinert, wird das Potenzial, den Kautschukanbau zu beschleunigen und die Gummiproduktion zu verbessern, greifbarer. Wenn das alles klappt, könnten diese Fortschritte der wachsenden globalen Nachfrage nach natürlichem Gummi gerecht werden und gleichzeitig die Gesamtqualität und die Eigenschaften der Kautschukbäume, die in der Produktion verwendet werden, verbessern.
Titel: An optimized somatic embryo transformation system assisted homozygous edited rubber tree generation method mediated by CRISPR/Cas9
Zusammenfassung: Previously, we have realized the CRISPR/Cas9-RNP and plasmid mediated protoplast transient transformation genome editing in the rubber tree (Hevea brasiliensis), but no gene editing plants were acquired due to the bottleneck of genetic transformation. In present study, antibiotic sensitivity tests against kanamycin, hygromycin and basta were analyzed for embryo screening, the results demonstrated that 10 mg/L hygromycin is the best for transformation. Then Agrobacterium mediated transformation of H. brasiliensis embryos was carried out using a pCAMBIA1300-based CRISPR/Cas9 vector targeting Phytoene desaturase gene (HbPDS). High-throughput sequencing of T0 generation positive embryos which were used as regeneration materials in typical transformation procedure showed that more than 90% T0 edited embryos are chimeric with a 3.2% editing efficiency. A T0 embryo with 9.8% edited cells was sliced into small pieces for one more cycle embryogenesis to produce T1 generation embryos in order to improve the ratio of homozygous embryos. Subsequently, next-generation sequencing (NGS) demonstrated that 29 out of 33 T1 embryos were edited, nearly 50% of which were found homozygous. At last, besides four chimeric plantlets with partial albino leaves, four plantlets with complete albino phenotype were regenerated from the 29 T1 generation edited embryos, among which one is a homozygous mono-allelic mutant and the other three are homozygous bi-allelic mutants. NGS demonstrated that the threshold for the proportion of edited cells with expected albino phenotype is between 70-85%. Additionally, Tail-PCR indicate that the T-DNA was inserted into different genome positions in the four homozygous edited plantlets, combined with the different genotypes are considered, the four homozygous plantlets can be confirmed as independently derived from single transformed cells. Overall, this is the first edited rubber trees with expected phenotype reported publicly, which shows the potential in genetic improvement of H. brasiliensis by CRISPR/Cas9 gene editing, and subculture of T0 positive transformed somatic embryos into T1 generation is proved to be an effective and necessary procedure to produce homozygous transgenic plantlets. This study presents a significant advancement in transgenic and gene editing for rubber tree.
Autoren: Tiandai Huang, X. Yang, Q. Lin, J. Udayabhanu, Y. Hua, X. Dai, S. Xin, X. Wang
Letzte Aktualisierung: 2024-03-29 00:00:00
Sprache: English
Quell-URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.14.585007
Quell-PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.14.585007.full.pdf
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