Mapping von Protein-Metabolit-Interaktionen in E. coli

Protein-Metabolit-Interaktionsnetzwerke (PMI) sind komplexe Systeme, die bisher noch nicht so richtig erforscht wurden, selbst bei einfachen Modellorganismen. Metaboliten sind kleine Moleküle, die verschiedene Aktivitäten von Proteinen regulieren können, wie zum Beispiel wie sie mit anderen Proteinen interagieren, wo sie innerhalb einer Zelle lokalisiert sind und ihre verdichteten Zustände. Diese Interaktionen zu verstehen, ist wichtig, da sie eine entscheidende Rolle in den Zellfunktionen spielen. Zum Beispiel haben Studien gezeigt, dass etwa 75 % der Transkriptionsfaktoren in Escherichia coli Teile haben, die mit kleinen Molekülen binden können. PMI-Netzwerke sind dynamisch und können sich schnell als Reaktion auf verschiedene Umwelt- oder Entwicklungssignale ändern.

Neueste Forschungen haben gezeigt, dass ein einzelnes Protein mit mehreren kleinen Molekülen interagieren kann, was helfen kann, neue regulatorische Verbindungen zu identifizieren. Es gibt traditionelle biochemische Methoden, um diese Interaktionen zu identifizieren, von der Verwendung spezifischer Proteine oder Metaboliten als Köder bis hin zu neueren Techniken, die Änderungen der Eigenschaften von Proteinen messen, wenn kleine Moleküle binden. Diese Methoden haben jedoch ihre Einschränkungen, besonders weil sie darauf angewiesen sind, das richtige Protein oder Metabolit zur Verfügung zu haben.

Um diese Herausforderungen anzugehen, haben Wissenschaftler eine Methode namens PROMIS entwickelt, die für PROtein-Metabolite Interaktionen unter Verwendung von Grössentrennung steht. Diese Methode nutzt eine Technik namens Co-Fraktionierungs-Massenspektrometrie (CF-MS), um Protein-Metabolit-Komplexe zu kartieren, ohne spezifische Köder zu benötigen. Der CF-MS-Ansatz kombiniert die Trennung ganzer Proteinkomplexe mit einer detaillierten Analyse ihres Inhalts. Diese Methode war hilfreich beim Aufbau umfassender Interaktionsnetzwerke über verschiedene Organismen hinweg.

In der ursprünglichen PROMIS-Methode trennen sich verschiedene Komponenten in einer Probe basierend auf ihrer Grösse. Metaboliten, die an Proteinkomplexe gebunden sind, neigen dazu, früher als ungebundene kleine Moleküle zu eluieren. Dadurch konnten die Forscher identifizieren, welche Metaboliten mit Proteinen interagieren. In diesen Experimenten kann jedoch ein einzelner Metabolit oft mit vielen Proteinen co-fraktionieren, was es schwierig macht zu bestimmen, welche echte Interaktionen sind.

Um die Genauigkeit bei der Identifizierung dieser echten Interaktionen zu verbessern, schlugen die Forscher vor, zwei verschiedene chromatographische Methoden zu kombinieren: Grössenausschlusschromatographie (SEC) und Ionenwechselchromatographie (IEX). Die Idee ist, dass Proteine, die in der Grösse ähnlich sind, sich in ihrer Ladung unterscheiden können, was es einfacher macht, zwischen echten Bindungen und zufälligem Co-Eluation zu unterscheiden. Früheren Methoden haben gezeigt, dass die Verwendung von zwei verschiedenen Chromatographie-Technologien zu einer besseren Trennung und Identifizierung dieser Interaktionen führen kann.

#Der experimentelle Ansatz

Um diese Hypothese zu testen, konzentrierten sich die Forscher auf E. coli, weil es eine einfachere Gruppe von Proteinen und Metaboliten hat, was das Studieren erleichtert. Die Integration von PROMIS und IEX würde idealerweise helfen, die Interaktionen zwischen Proteinen und Metaboliten zu klären.

Der erste Schritt bestand darin, E. coli in einer kontrollierten Umgebung zu züchten, bis sie eine spezifische Wachstumsphase erreicht hatten. Die Zellen wurden dann geerntet und verarbeitet, um Proteine und Metaboliten zu extrahieren. Mit Hilfe der Grössenausschlusschromatographie trennten die Forscher Proteine und Metaboliten basierend auf ihrer Grösse. Dieser Schritt generierte mehrere Fraktionen mit Proteinen und Metaboliten, die dann mit Massenspektrometrie-Techniken weiter analysiert wurden.

IEX wurde auf die gleichen Proben angewendet, um eine andere Fraktionensätze zu erstellen. In diesem Prozess wurde auch eine Kontrollprobe vorbereitet, bei der der Lysat erhitzt wurde, um die Proteine zu denaturieren. Durch den Vergleich der Elutionsprofile der Probe und der Kontrolle konnten die Forscher besser identifizieren, welche Metaboliten wahrscheinlich an Proteine gebunden waren.

Das Ziel war es, ein umfassendes PMI-Netzwerk aufzubauen, indem Paare von Proteinen und Metaboliten gefunden wurden, die in beiden SEC- und IEX-Trennungen über mehrere Wiederholungen des Experiments co-eluierten. Ein bedeutender Befund dieser Arbeit war, dass bestimmte Metaboliten in allen Datensätzen mit spezifischen Proteinen auftreten, was auf eine wahrscheinliche Interaktion hinweist.

#Kartierung des Interaktoms

Um ein vollständiges Bild des PMI-Netzwerks in E. coli zu erstellen, analysierten die Forscher alle identifizierten Metabolit-Protein-Paare und suchten nach konsistenten Interaktionen über mehrere Experimente hinweg. Sie fanden eine grosse Anzahl von Verbindungen, die ein komplexes Netzwerk von Interaktionen zeigten.

Proteom- und Metabolom-Analysen enthüllten viele Proteine und Metaboliten, darunter wichtige Stoffwechselzwischenprodukte, Aminosäuren und andere Verbindungen. Die Gesamtergebnisse zeigten, dass IEX effektiv Protein-Metabolit-Komplexe inmitten einer komplexen Mischung zellulärer Inhalte trennen konnte.

Die funktionale Analyse der identifizierten Proteine deutete darauf hin, dass viele von ihnen an grundlegenden Zellfunktionen beteiligt sind, insbesondere am Stoffwechsel. Beispielsweise waren Interaktionen zwischen Nukleotidmonophosphaten und Ribosomen aufgrund ihrer Rolle in der Translation zu erwarten.

Die Ergebnisse zeigten auch, dass verschiedene Klassen von Metaboliten mit unterschiedlichen Satz von Proteinen interagierten. Aminosäuren zeigten Interaktionen mit Enzymen, die in der Aminosäurebiosynthese beteiligt sind, während Dipeptide – kurze Ketten von Aminosäuren – ihr eigenes einzigartiges Set von Interaktionen hatten, die viele mit dem Stickstoffstatus und dem Proteinmetabolismus zusammenhingen.

#Neue Interaktionen und ihre Implikationen

Innerhalb der umfangreichen Liste von Interaktionen stachen einige besonders hervor und könnten Einblicke in neuartige regulatorische Mechanismen bieten. Beispielsweise deuten Interaktionen mit Dipeptiden und Enzymen, die mit dem Lipidstoffwechsel in Verbindung stehen, auf eine mögliche regulatorische Rolle dieser kleinen Moleküle hin, die den Proteinabbau mit der Lipidsynthese verbinden könnten.

Ein spezifisches Beispiel von Interesse war die Interaktion zwischen einem Dipeptid namens Val-Leu und einem Enzym namens FabF, das für die Fettsäure-Elongation wichtig ist. Durch die Verwendung einer anderen Methode namens Mikroskala-Thermophorese bestätigten die Forscher, dass Val-Leu tatsächlich an FabF bindet, was beeinflussen könnte, wie Fettsäuren hergestellt werden.

Sie fanden auch eine Verbindung namens Lumichrome, ein Derivat von Riboflavin, die in ihrem E. coli PMI-Netzwerk vorhanden war. Lumichrome zeigte potenzielle Interaktionen mit verschiedenen Proteinen, einschliesslich eines, der an der Synthese von Pyrimidin-Nukleotiden beteiligt ist. Durch den Vergleich mit früheren Studien aus anderen Organismen identifizierten die Forscher, dass einige der mit Lumichrome interagierenden Proteine über Arten hinweg erhalten geblieben waren.

Als sie den Einfluss der Lumichrome-Bindung auf das Enzym PyrE bewerteten, beobachteten sie, dass Lumichrome die Aktivität von PyrE hemmte. Diese Hemmung könnte die Produktion von Verbindungen beeinflussen, die für die Biofilm-Bildung in Bakterien notwendig sind, was auf eine potenzielle Rolle von Lumichrome im Management der Biofilm-Dynamik hindeutet.

#Zukünftige Aussichten

Durch die kombinierten Methoden von SEC und IEX wurde eine genauere Kartierung des PMI-Netzwerks erreicht. Diese Zweipunkttechnik bietet ein detaillierteres Verständnis dafür, wie Proteine und Metaboliten interagieren, was eine bessere Identifizierung neuartiger Paarungen ermöglicht, die zuvor möglicherweise unbemerkt geblieben sind.

Die Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Metabolit-Interaktionen erhebliche Auswirkungen auf biologische Prozesse haben könnten, einschliesslich Stoffwechsel und Biofilm-Bildung. Zukünftige Studien könnten diese Interaktionen weiter untersuchen, um ihre biologische Bedeutung und Rollen in der zellulären Regulation zu verstehen.

Zudem sind weitere Untersuchungen notwendig, um vollständig zu verstehen, wie diese Interaktionen das Zellverhalten unter verschiedenen Bedingungen beeinflussen. Durch die Validierung der identifizierten Interaktionen durch zusätzliche Studien und experimentelle Methoden zielen die Forscher darauf ab, tiefere Einblicke in die Komplexität des Zellstoffwechsels zu gewinnen.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Bedeutung der Kombination verschiedener Techniken zur Untersuchung von Protein-Metabolit-Interaktionen. Die Erkenntnisse könnten den Weg für weitere Forschungen ebnen, wie diese Interaktionen wesentliche Rollen bei der Regulierung grundlegender Prozesse in Zellen spielen, mit Implikationen für das Verständnis bakteriellen Verhaltens, Stoffwechsel und möglicherweise die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.