Neue SDDWP-sSMLM-Technologie verbessert die molekulare Bildgebung

Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) ist eine Art von fortschrittlicher Bildgebungstechnik, die in vielen wissenschaftlichen Bereichen eingesetzt wird. Sie sticht hervor, weil sie eine kostengünstige Möglichkeit bietet, hochdetaillierte Bilder zu erzielen, verglichen mit anderen Techniken wie der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) oder der stimulierten Emission Depletion (STED). Der Hauptvorteil von SMLM liegt darin, dass sie hauptsächlich auf regulären Fluoreszenzmikroskopen und spezieller Software zum Aufnehmen und Analysieren von Bildern basiert. Diese Benutzerfreundlichkeit hat SMLM bei Forschern beliebt gemacht, die winzige Strukturen auf molekularer Ebene sehen möchten.

Im Laufe der Zeit haben Wissenschaftler nach Wegen gesucht, um noch bessere Ergebnisse mit SMLM zu erzielen. Ein grosses Gebiet, das sie verbessern möchten, ist die multiplexierte Bildgebung, was bedeutet, dass Bilder mit mehreren Farben gleichzeitig aufgenommen werden. Während einige Methoden entwickelt wurden, um unterschiedliche gefärbte Moleküle zu trennen, können sie nur eine begrenzte Anzahl von Farben gleichzeitig nutzen. Es gibt auch eine Methode, bei der verschiedene Farben nacheinander aktiviert werden, aber das dauert viel Zeit.

#Fortschritte in der SMLM

Um die Einschränkungen der traditionellen SMLM-Methoden zu beheben, wurde ein neuer Ansatz namens spektroskopische SMLM (sSMLM) eingeführt. Diese Methode verbessert die reguläre SMLM, indem sie eine spezielle Linse hinzufügt, wie ein Beugungsgitter oder ein Prisma. Diese Elemente helfen nicht nur, die Position einzelner Moleküle zu erfassen, sondern auch deren Farbeigenschaften gleichzeitig. Durch die Analyse des gesamten Lichtspektrums, das von Molekülen emittiert wird, kann sSMLM theoretisch viele Farben zusammen verwenden, was es ermöglicht, komplexere Bilder zu erstellen, ohne die Qualität zu opfern.

Frühere Versionen von sSMLM hatten jedoch einige Nachteile. Zum Beispiel senkte die Art und Weise, wie Farben getrennt wurden, oft die Präzision der Bilder. Um dies zu überwinden, wurde ein neues Design namens symmetrisch dispergierte sSMLM (SDsSMLM) entwickelt. Dieses Design verwendet eine spezielle Anordnung von Linsen, um sicherzustellen, dass die Photonen effektiver genutzt werden, was zu einer besseren Bildqualität führt.

Ein weiterer Fortschritt kam mit der Einführung eines Doppelkeilprismas (DWP). Dieses neue Design ermöglicht eine noch bessere Nutzung des Lichts, was zu einer verbesserten Präzision in lateralen und axialen Richtungen führt. Mit diesen Entwicklungen sind Forscher jetzt in der Lage, genauere und detailliertere Bilder zu erhalten, ohne komplizierte Setups zu benötigen.

#Neue SDDWP-sSMLM-Technologie

Die neueste Version dieser Bildgebungstechnologie nennt sich symmetrisch dispergiertes Doppelkeilprisma sSMLM (SDDWP-sSMLM). Diese Technologie verwendet zwei DWPs, was bedeutet, dass sie Licht in beiden positiven und negativen spektralen Richtungen erfassen kann. Dadurch wird die Menge des gesammelten Lichts für die Analyse maximiert. Dies ist besonders nützlich, wenn man mit normalen Fluoreszenzmikroskopen arbeitet, da das neue Setup leicht angebracht werden kann und keine komplizierten Anpassungen erfordert.

Die Einfachheit dieser neuen Technologie macht sie weit zugänglich, sodass viele Forscher von hochwertigen Bildgebungsfähigkeiten profitieren können.

#Überblick über den SDDWP-sSMLM-Prozess

#Probenvorbereitung für die Bildgebung

Um die Fähigkeiten von SDDWP-sSMLM zu testen, müssen Wissenschaftler spezifische Proben vorbereiten. Zur Kalibrierung verwenden sie oft ein massgeschneidertes Nanolocharray. Dieses Array wird erstellt, indem eine dünne Schicht Aluminium auf eine Glasoberfläche aufgetragen und dann winzige Löcher mit fokussierter Ionenstrahlbearbeitung erzeugt werden. Dies dient als Referenz zur Überprüfung der Genauigkeit des Bildgebungssystems.

Neben den Kalibrierungszielen bereiten die Wissenschaftler auch Proben von fluoreszierenden Mikrosphären vor, um das Bildgebungssystem zu validieren. Die Mikrosphären werden verdünnt und auf einen speziellen Glasobjektträger gelegt, um die Bedingungen der tatsächlichen biologischen Proben, die sie untersuchen möchten, zu entsprechen.

Für biologische Proben verwenden Forscher oft Fluoreszierende Farbstoffe, um spezifische Strukturen innerhalb von Zellen anzusprechen. Zum Beispiel könnten sie unterschiedliche Farbstoffe verwenden, um Mitochondrien, Mikrotubuli und andere wichtige Teile der Zelle sichtbar zu machen.

#Bildgebungseinrichtung

Die SDDWP-sSMLM-Anlage basiert auf früheren SMLM-Systemen. Sie nutzt ein inverses Mikroskop mit einer Hochleistungslinse, um Proben mit einem spezifischen Laser zu beleuchten. Das von der Probe emittierte Licht wird dann durch spezielle Filter erfasst, was einen klaren Bildweg zur Analyse der von den Proben emittierten Fluoreszenz ermöglicht.

Die Einrichtung für die Bildgebung kann sowohl für die zweidimensionale (2D) als auch für die dreidimensionale (3D) Bildgebung konfiguriert werden. In der 2D-Einrichtung ist der Lichtweg so gestaltet, dass die Bilder korrekt auf eine wissenschaftliche Kamera fokussiert werden. In der 3D-Anordnung werden zwei separate Bilder aus leicht unterschiedlichen Winkeln aufgenommen, die Tiefeninformationen über die Proben liefern.

#Kalibrierungsverfahren

Bevor der Bildprozess beginnt, ist die Kalibrierung wichtig. Zunächst verwenden die Forscher das Nanolocharray, um die Positionen der im System erfassten Bilder abzugleichen. Dies hilft sicherzustellen, dass die aus den Bildern entnommenen Messungen genau sind. Sie führen verschiedene Tests mit unterschiedlichen Lichtfiltern durch, um zu überprüfen, wie gut das System verschiedene Wellenlängen von Licht unterscheiden kann.

Als nächstes, um sich auf die Bildgebung der biologischen Proben vorzubereiten, nehmen sie Messungen von fluoreszierenden Mikrosphären in unterschiedlichen Tiefen. Dies ermöglicht es ihnen, zu verstehen, wie gut das System Bilder an verschiedenen axialen Orten erfassen kann.

#Bildverarbeitungstechniken

Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, müssen die Wissenschaftler die gesammelten Daten analysieren. Sie verwenden spezielle Software, um einzelne Moleküle oder die durch das Nanolocharray geschaffenen Punkte zu identifizieren. Die Software hilft, wichtige Informationen wie die Grösse und Position dieser Punkte zu bestimmen.

Im Fall der 3D-Bildgebung hilft die Software auch, Tiefeninformationen abzuleiten und zwischen verschiedenen fluoreszierenden Markierungen zu unterscheiden. Daten aus mehreren Frames können zusammen verarbeitet werden, um ein klares Bild der untersuchten Probe zu liefern.

#Ergebnisse und Erkenntnisse

Um die Effektivität von SDDWP-sSMLM zu bewerten, vergleichen die Forscher die Ergebnisse mit früheren Methoden. Sie überprüfen, wie gut das neue System in Bezug auf laterale Präzision funktioniert, was bedeutet, wie genau das System Moleküle in der Ebene der Probe lokalisieren kann.

Die neue SDDWP-sSMLM-Technologie zeigt signifikante Verbesserungen darin, wie präzise sie diese Moleküle im Vergleich zu älteren Methoden lokalisieren kann. Zum Beispiel kann die SDDWP-sSMLM bei einer gegebenen Anzahl emittierter Photonen eine laterale Präzision von bis zu 27 % besser erreichen als ihre Vorgängersysteme.

Die gleichen Verbesserungen zeigen sich auch bei der spektralen Präzision, die misst, wie genau das System die Farben des von den verschiedenen Molekülen emittierten Lichts identifizieren kann. Der Anstieg der spektralen Präzision ist ziemlich erheblich und erreicht sogar Zahlen, die eine klarere Identifizierung von eng überlappenden Farben ermöglichen.

Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit des Systems zur 3D-Bildgebung Tiefeninformationen, die in früheren Versionen nicht so genau waren. Die Verbesserungen sowohl in axialer als auch in lateraler Präzision machen SDDWP-sSMLM zu einem wertvollen Werkzeug für das Studium komplexer biologischer Strukturen.

#Zellbildanwendungen

Um die praktische Anwendung dieser neuen Bildgebungstechnologie zu demonstrieren, verwendeten die Forscher SDDWP-sSMLM, um HeLa-Zellen zu visualisieren, die häufig in Laboruntersuchungen verwendet werden. Die Zellen wurden mit spezifischen Farbstoffen behandelt, die verschiedene Strukturen innerhalb der Zelle ansprechen.

Die Ergebnisse zeigten, dass das Bildgebungssystem die komplexen Beziehungen zwischen Mitochondrien, Mikrotubuli und anderen Zellkomponenten effektiv visualisieren konnte. Die Tiefe der erfassten Informationen ermöglichte ein nuancierteres Verständnis dafür, wie diese Strukturen innerhalb lebender Zellen interagieren.

Neben der Darstellung der verschiedenen Strukturen lieferte die Software eine tiefencodierte Rekonstruktion der Zellen. Das bedeutet, dass die Forscher die Position verschiedener Komponenten im dreidimensionalen Raum der Zellen visualisieren konnten, was ihr Verständnis der zellulären Mechanismen verbesserte.

#Fazit

Dieser Fortschritt in der SMLM-Technologie, insbesondere mit dem SDDWP-sSMLM, hat neue Möglichkeiten für Forscher eröffnet, die an der Untersuchung molekularer Interaktionen interessiert sind. Die hohe räumliche und spektrale Präzision, die mit dieser Technologie erreicht wird, wird voraussichtlich ein besseres Verständnis komplexer biologischer Prozesse erleichtern.

Mit der Fähigkeit, detaillierte Bilder von lebenden Zellen und ihren komplizierten Strukturen zu erfassen, wird SDDWP-sSMLM voraussichtlich ein transformatives Werkzeug in der wissenschaftlichen Forschung sein. Da immer mehr Forscher diese Technologie übernehmen, wird es wahrscheinlich zu neuen Entdeckungen in verschiedenen Bereichen kommen, von Biologie und Medizin bis hin zur Materialwissenschaft.

Die Forscher sind begeistert von den Implikationen dieser Erkenntnisse, da sie hochauflösende Bildgebung mit Benutzerfreundlichkeit kombinieren. Die Zukunft der Zellbildgebung sieht vielversprechend aus, wobei SDDWP-sSMLM den Weg für neue Einblicke in die Welt der molekularen Interaktionen ebnet.