Neues Tool sagt die optimalen Protein-Tag-Standorte voraus

Wissenschaftler nutzen Antikörper, um Proteine in Zellen zu untersuchen. Antikörper können zeigen, wo Proteine sich befinden, wie viel davon vorhanden ist, wie sie sich innerhalb der Zellen bewegen und wie sie miteinander interagieren. Allerdings ist es oft echt schwierig, hochwertige Antikörper für die meisten Wirbeltierproteine zu finden. Viele Firmen verkaufen Antikörper für spezielle Proteine, aber die funktionieren oft nicht gut in echten Zellumgebungen oder zielen nicht auf das richtige Protein ab. Eigene Antikörper in Laboren zu erstellen ist auch teuer und zeitaufwendig, und diese Bemühungen schlagen oft fehl, was wertvolle Forschung Ressourcen verschwendet.

Eine Möglichkeit ist, Proteine mit speziellen Tags zu erstellen, die von Antikörpern erkannt werden können, aber diese Methode hat ihre Herausforderungen. Einfache Tags an den Enden von Proteinen können Problemchen verursachen, vor allem, wenn diese Enden wichtig für die Funktion des Proteins sind. Eine alternative Methode besteht darin, Gruppen von internen Tags mit einer komplexen Technik zu erstellen, die zwar effektiv ist, aber auch viel Arbeit erfordert. Diese Situation zeigt, dass es dringend einfache Werkzeuge braucht, die genau vorhersagen können, wo Tags an Proteine angefügt werden können, ohne deren Funktion zu beeinträchtigen.

#Verfügbare Werkzeuge

Es gibt viele Online-Ressourcen, die helfen können, die richtigen Stellen für Tags an Proteinen zu finden. Diese Ressourcen schauen auf verschiedene Merkmale, wie ähnlich ein Protein über verschiedene Arten hinweg ist, seine vorhergesagte Form, wie zugänglich jeder Teil des Proteins ist und ob bestimmte Bereiche des Proteins wahrscheinlich flexibel oder ungeordnet sind. Frühere Studien haben gezeigt, dass die gemeinsame Nutzung dieser Merkmale helfen kann, vorherzusagen, wo am besten Tags an Proteine angebracht werden sollten.

#Das EpicTope Tool

Wir stellen ein neues Tool namens EpicTope vor, das diese Merkmale kombiniert, um die besten Plätze für das Hinzufügen von Tags zu Proteinen zu finden, ohne deren Funktion zu stören. Um sicherzustellen, dass EpicTope gut funktioniert, haben wir es an einem Protein namens Smad5 in Zebrafischen getestet. Smad5 ist ein wichtiger Teil eines Signalwegs, der die Zellentwicklung in Zebrafischen kontrolliert. Dieses Protein ist über verschiedene Arten hinweg sehr ähnlich, was das Taggen herausfordernd macht, denn schon eine kleine Veränderung kann seine Leistung beeinträchtigen.

Wir haben EpicTope verwendet, um zwei interne Stellen an Smad5 zu finden, wo wir V5-Tags hinzufügen konnten. Dann haben wir verschiedene Versionen des Smad5-Proteins mit diesen Tags erstellt, sowie Versionen mit Tags an den Enden des Proteins zum Vergleich. Unsere Experimente zeigten, dass die Smad5-Proteine mit internen Tags in Zebrafisch-Embryonen richtig funktionierten, während die mit Tags an den Enden das nicht taten. Wir haben auch bestätigt, dass die internen Tags es ermöglichten, die Proteine von Antikörpern erkannt zu werden.

#Wie EpicTope funktioniert

EpicTope schaut sich verschiedene Merkmale eines Proteins an, um zu entscheiden, wo ein Tag hinzugefügt werden soll. Es beginnt damit, ein Protein basierend auf einem bestimmten Identifikator auszuwählen. Dann sammelt es Informationen über die Aminosäuresequenz und die vorhergesagte Struktur des Proteins. Diese Struktur hilft, die Form des Proteins und wie seine Teile miteinander interagieren, zu verstehen.

Als Nächstes verwendet EpicTope eine Methode, um zu bewerten, wie ähnlich das Protein seinen Gegenstücken in anderen Arten ist. Es untersucht, welche Teile des Proteins wahrscheinlich strukturiert (wie α-Helices oder β-Faltblätter) oder ungeordnet sind. EpicTope prüft auch, wie offen oder geschlossen verschiedene Regionen des Proteins sind und ob es Bindungsbereiche gibt, die für seine Funktion wichtig sein könnten.

Sobald all diese Informationen gesammelt sind, kann EpicTope Punkte vergeben, die helfen, die besten Stellen zum Hinzufügen von Tags an dem Protein zu identifizieren. Die Positionen mit den höchsten Punkten zeigen gute Plätze für Tags an, die wahrscheinlich die Funktion des Proteins nicht stören.

#EpicTope testen

Um zu testen, wie gut EpicTope funktioniert, konzentrierten wir uns auf das Smad5-Protein in Zebrafischen. Mit dem Tool haben wir zwei spezifische Positionen innerhalb des Smad5-Proteins für das Hinzufügen von V5-Tags hervorgehoben. Dann führten wir Experimente durch, um zu überprüfen, ob diese getaggten Versionen von Smad5 normal funktionieren konnten.

In unseren Tests injizierten wir Zebrafisch-Embryonen, denen funktionelles Smad5 fehlte, mit den verschiedenen Smad5-Versionen. Die Embryonen, die das intern V5-getaggte Smad5 erhielten, zeigten eine deutliche Verbesserung in ihrer Entwicklung, was darauf hindeutet, dass diese Proteine ihre Aufgaben gut erfüllen konnten. Die Embryonen, die mit Smad5-Versionen mit Tags an den Enden injiziert wurden, zeigten dagegen keine ähnlichen Ergebnisse, was bestätigte, dass diese Tags die Funktion des Proteins beeinträchtigten.

Wir haben auch die Mengen der getaggten Proteine untersucht, um zu sehen, ob die Tags ihre Stabilität beeinflussten. Die internen Tags schienen stabil und in den Embryonen vorhanden zu sein, während die Version mit dem Tag am Anfang viel weniger stabil war. Das verstärkte die Idee, dass die internen Tags vorteilhaft waren.

#Visualisierung der Proteinlokalisation

Um die Effektivität unseres Tagging-Ansatzes weiter zu überprüfen, verwendeten wir eine Methode namens Immunfluoreszenz, um zu sehen, wo sich die Smad5-Proteine in den Embryonen befanden. Wir färbten die Embryonen mit speziellen Markern, die sich an die V5-Tags binden, und beobachteten ihre Positionen mit einem leistungsstarken Mikroskop.

Unsere Beobachtungen zeigten, dass die V5-getaggten Smad5-Proteine in den erwarteten Bereichen innerhalb der Zellen vorhanden waren, besonders in den Zellkernen, wo die Aktionen im Zusammenhang mit BMP-Signalgebung stattfinden. Das stimmte mit den Ergebnissen der Rettungsexperimente der Embryonen überein. Die Versionen mit Tags an den Enden zeigten währenddessen keine ähnlichen Muster in der Färbung.

#Fazit

Die hier durchgeführte Arbeit zeigt, dass EpicTope ein wertvolles Werkzeug für Wissenschaftler ist, die vorhersagen möchten, wo man Tags an Proteinen anbringen kann, ohne deren Funktion zu stören. Mit EpicTope können Forscher getaggte Proteine erzeugen, die funktional bleiben und von Antikörpern für zukünftige Studien zugänglich sind.

Unser Ansatz ist vielversprechend für verschiedene Anwendungen, von der Verfolgung von Proteinen in lebenden Zellen bis hin zur Identifizierung spezifischer Zielstrukturen für Studien zur Genregulation. Wir hoffen, dass EpicTope vielen Forschern bei ihren Bemühungen hilft, die komplexe Welt der Proteine und deren Rolle im lebenden Organismus zu erkunden.