Verbesserung der Mannanase-Produktion für Tierfutter

Hemicellulose ist ein wichtiger Bestandteil von Pflanzenzellwänden und der zweithäufigste natürliche Polymer nach Cellulose. In verschiedenen Pflanzenarten gibt's verschiedene Formen von Hemicellulose. Bei Gräsern und Laubbäumen nennt man die Hauptform Xylan. Bei Nadelhölzern, Früchten und Samen ist die dominante Form eine Substanz, die Mannan heisst. Mannan ist eine Art Kohlenhydrat, das hauptsächlich aus einem Zucker namens D-Mannose besteht. Dieser Zucker dient in Pflanzen sowohl als Energiespeicher als auch als strukturelle Unterstützung.

Mannan kommt in verschiedenen Formen vor: lineares Mannan, Glucomannan, Galactomannan und Galactoglucomannan. Wegen seiner unterschiedlichen Struktur braucht man eine Mischung aus verschiedenen Enzymen, um Mannan abzubauen, wie z. B. β-Mannanase und andere. Das Enzym β-Mannanase ist besonders wichtig und hat in verschiedenen Branchen wie Ölbohrungen, Textilien und Tierfutter an Interesse gewonnen.

Mannan und Tierfutter

In der Tierfutterindustrie hat die Zugabe von β-Mannanase zu hochfaserigen Diäten den Tieren auf verschiedene Weise geholfen. Zum Beispiel, als Broiler-Hühner Futter mit Galactomannan bekamen, verbesserte die Zugabe von β-Mannanase ihr Wachstum und reduzierte die Dicke ihrer Därme. Ähnlich zeigten Tilapia-Fische, die pflanzenbasierte Diäten mit hinzugefügtem β-Mannanase bekamen, bessere Gewichtszunahmen und eine verbesserte Futterverwertung.

Ein wichtiger Bestandteil in Tierfutter, der von β-Mannanase profitieren könnte, ist Palmkernkuchen (PKC), der aus der Palmölproduktion stammt. PKC gibt's in zwei Arten: Palmkernmehl (PKM) und Palmkernpresskuchen (PKE). Das sind Nebenprodukte der Palmkerneölgewinnung und können gute Alternativen zu gängigen Futterbestandteilen wie Mais und Sojamehl sein. Allerdings hat PKC einen hohen Anteil an unverdaulicher Faser, hauptsächlich in Form von Mannan. Dadurch ist es weniger effektiv, um nicht-wiederkäuende Tiere wie Schweine und Hühner zu füttern.

Neue Ansätze zur Verbesserung der PKC-Nutzung

Viele Forscher haben versucht, den Fasergehalt von PKC zu reduzieren, entweder durch direkte Zugabe von Enzymen oder durch mikrobielle Fermentation. Allerdings können kommerzielle Enzyme teuer sein im Vergleich zum Gesamtwert des Tierfutters. Eine vielversprechende Alternative ist die mikrobielle Fermentation. Bei diesem Prozess können die notwendigen Enzyme vor Ort natürlich produziert werden, was hilft, die Faser abzubauen.

Pilzarten wie Aspergillus und bestimmte Bakterien wie Bacillus können Mannan abbauen. Doch die meisten Studien zeigen, dass die Fermentation mehrere Tage dauert, was die Kosten erhöhen und das Risiko von Kontaminationen steigern kann. Zum Beispiel fand eine Studie heraus, dass die Fermentation von PKE mit Aspergillus niger für etwas mehr als zwei Tage den Proteingehalt signifikant verbesserte und den Faseranteil reduzierte. Eine andere Studie zeigte ähnliche positive Ergebnisse mit verschiedenen Bakterienstämmen nach einwöchiger Fermentation.

#Feststofffermentation von Palmkernkuchen

Die meisten Studien konzentrierten sich darauf, wie die Feststofffermentation die Nährwerte von PKE beeinflusst. PKM hingegen wird oft weniger bevorzugt in der Tierfütterung aufgrund des niedrigeren Energiegehalts. Aus diesem Grund haben Forscher untersucht, wie die Feststofffermentation die Qualität von PKM verbessern kann.

In einer aktuellen Studie isolierten Wissenschaftler einen Bacillus Subtilis-Stamm, der schnell Mannanase produzierte, als er PKM ausgesetzt wurde, und den Fasergehalt innerhalb von nur einem Tag Fermentation signifikant reduzierte. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Mannanaseproduktion durch Gentechnik weiter zu steigern, um mehr Faserabbau ohne Verlängerung der Fermentationszeit zu ermöglichen.

#Gentechnik zur Verbesserung der Mannanase-Produktion

Um die Mannanase-Expression zu verbessern, veränderten die Forscher das Plasmid, das im Bacillus-Stamm verwendet wurde. Dazu gehörte die Veränderung von Elementen wie dem Signalpeptid und der ribosomalen Bindungsstelle, um die Produktion des Enzyms zu optimieren. Sie konzentrierten sich darauf, einen spezifischen Promoter, PnprE, zu verwenden, der während der PKM-Fermentation die höchste Aktivität zeigte.

Nach der Optimierung dieser verschiedenen Elemente wurde eine Zeitstudie durchgeführt, um zu sehen, wie sich unterschiedliche Bacillus subtilis-Stämme bezüglich der Mannanase-Produktion und des Faserabbaus von PKM verhielten. Der gentechnisch veränderte Stamm produzierte signifikant mehr Mannanase als der Originalstamm und erzielte beeindruckende Ergebnisse in kurzer Fermentationszeit.

#Materialien und Methoden

#Stämme und Kultivierung

Für diese Studie wurden verschiedene Bacillus subtilis-Stämme verwendet. Dazu gehörten Stämme, die aus Palmfrüchten isoliert wurden, und solche, die aus genetischen Zentren stammen. Diese Stämme wurden in einem speziellen Brühemedium bei kontrollierten Temperaturen gezüchtet. Verschiedene Antibiotika wurden hinzugefügt, um sicherzustellen, dass die richtigen Stämme erfolgreich wachsen.

#Gentechnische Manipulation des Mannanase-Gens

Die Forscher klonten das Gen, das für die Produktion von Mannanase verantwortlich ist, aus Bacillus subtilis in ein Plasmid. Dieses Plasmid wurde dann in die Bacillus-Stämme eingeführt, um zu sehen, wie sie die Mannanase-Produktion beeinflussten.

#Fermentationsprozess

Für die Fermentation wurde PKM sterilisiert und mit den Bacillus-Zellen gemischt. Diese Mischung durfte etwa 22 bis 24 Stunden bei optimaler Temperatur fermentieren. Danach wurde das fermentierte PKM auf Mannanase-Aktivität und Veränderungen im Faser- und Proteingehalt analysiert.

#Mannanase-Aktivitätstest

Um die Enzymaktivität zu testen, wurden spezifische Kohlenhydrate verwendet. Die Forscher massen die Menge an reduzierenden Zuckern, die während der Reaktion produziert wurden, was anzeigte, wie effektiv die Mannanase arbeitete.

#Analyse von Faser- und Proteingehalt

Zur Bestimmung des Faser- und Proteingehalts in den fermentierten Proben wurden verschiedene Standardmethoden angewendet. Dazu gehörte die Untersuchung der Proben unter spezifischen Bedingungen zur genauen Messung ihrer Nährstoffgehalte.

#Oberflächenmorphologie-Analyse

Um die physikalischen Veränderungen von PKM nach der Fermentation zu inspizieren, wurde die Oberfläche unter einem Rasterelektronenmikroskop analysiert. Das half dabei zu bestimmen, wie der Fermentationsprozess die Struktur von PKM beeinflusste.

#Ergebnisse und Diskussion

#Verbesserte Mannanase-Produktion

Nach verschiedenen Tests fanden die Forscher heraus, dass durch die Veränderung des Signalpeptids und der ribosomalen Bindungsstellen im Plasmid die Bacillus subtilis-Stämme signifikant mehr Mannanase produzieren konnten. Die Ergebnisse zeigten, dass dieser gentechnisch veränderte Stamm eine viel höhere Enzymaktivität im Vergleich zum Originalstamm sowohl unter Labor- als auch Fermentationsbedingungen hatte.

#Einfluss starker Promotoren

Um die Produktion von Mannanase zu maximieren, nutzten die Forscher einen starken Promotor, der auf früheren Transkriptomdaten basierte. Durch das Testen verschiedener Promotoren identifizierten sie denjenigen, der zu den höchsten Enzymproduktionslevels während der Fermentation führte.

#Zeitstudie der Fermentation

Eine Zeitstudie zeigte, dass der verbesserte Bacillus-Stamm in kürzerer Zeit mehr Mannanase produzierte. Das zeigte, dass die gentechnischen und Optimierungsstrategien effektiv funktionierten.

#Analyse des Nährstoffgehalts

Die Analyse ergab, dass, während die gentechnisch veränderten Stämme den Fasergehalt in PKM signifikant reduzierten, möglicherweise noch mehr Arbeit nötig ist, um alle Komponenten vollständig abzubauen. Weitere Versuche deuteten auf die Notwendigkeit zusätzlicher Enzyme hin, um den gesamten Faserabbauprozess zu unterstützen.

#Hochskalierte Fermentation

Die Forscher führten auch Versuche im grösseren Massstab durch, um zu sehen, wie gut der gentechnisch veränderte Stamm mit mehr PKM performen kann. Die Ergebnisse zeigten eine erhebliche Reduzierung des Fasergehalts und einen leichten Anstieg des Proteingehalts nach der Fermentation. Das hebt das Potenzial hervor, diese Methode für die Produktion von Tierfutter im grossen Massstab zu verwenden.

#Veränderungen der Oberflächenstruktur

Nach der Analyse der Oberflächenstruktur von PKM nach der Fermentation zeigte sich, dass das fermentierte PKM poröser erschien. Diese Veränderung resultierte wahrscheinlich aus dem enzymatischen Abbau der Fasern, was die Verdaulichkeit des Futters verbessert.

#Fazit

Diese Studie verbessert die Produktion von Mannanase in Bacillus subtilis durch gezielte Gentechnik. Durch die Optimierung verschiedener genetischer Elemente erzielten die Forscher signifikante Reduzierungen des Fasergehalts in PKM in kurzer Fermentationszeit. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einsatz solcher gentechnisch veränderter Stämme den Nährwert von PKM verbessern kann, was es geeigneter für Tierfutter macht.

Zukünftige Forschungen könnten sich darauf konzentrieren, die Kosten dieser Prozesse zu senken und Optionen zu erkunden, die keine Antibiotikaresistenzgene beinhalten. Insgesamt zeigt diese Arbeit das Potenzial zur Verbesserung der Verwendung von PKM als Futterbestandteil durch innovative biotechnologische Ansätze, die wahrscheinlich auch auf andere landwirtschaftliche Nebenprodukte in der Zukunft angewendet werden können.