Die Rolle von Sfp1 und NuA4 in der Ribosomenregulation

Zellen haben komplexe Systeme entwickelt, um auf Veränderungen in ihrer Umgebung zu reagieren. Bei der Knollenhefe spielt ein wichtiges Element in diesem Anpassungsprozess ein Protein namens TORC1. Dieses Protein hilft Zellen, wahrzunehmen, was aussen passiert, und Entscheidungen über Wachstum und Energieverbrauch basierend auf verfügbaren Nährstoffen und Stresslevels zu treffen. Eine der Hauptaufgaben, die von TORC1 reguliert wird, ist die Herstellung von Ribosomen, die für die Proteinsynthese unerlässlich sind.

#Ribosomenbildung in der Hefe

Hefe-Ribosomen bestehen aus 79 Arten von Proteinen, die von 139 verschiedenen Genen codiert werden. Der Prozess, Ribosomen zu bauen, ist energieaufwendig und beinhaltet viele verschiedene regulatorische Elemente, die als Regulons bekannt sind. Um Energieverschwendung zu vermeiden, müssen Zellen die Expression der ribosomalen Protein-Gene und ihrer Regulatoren sorgfältig steuern. Das erfordert verschiedene aktivierende Proteine, die helfen, wann und wie diese Gene aktiviert werden.

Unter den beteiligten Proteinen spielt Sfp1 eine entscheidende Rolle. Sfp1 ist eine Art Aktivator, der hilft, die Expression der ribosomalen Proteine und ihrer Regulatoren zu steuern, wenn die Nährstoffe schwanken. Bei normalen Wachstumsbedingungen aktiviert die TOR-Kinase Sfp1, indem sie eine Phosphatgruppe anfügt. Diese Modifikation ermöglicht es Sfp1, in den Zellkern zu gelangen, wo es mit anderen aktivierenden Proteinen zusammenarbeitet, um die Expression der ribosomalen Gene zu fördern. Wenn die Nährstoffe jedoch knapp werden oder die Zellen mit Rapamycin behandelt werden, einem Medikament, das TORC1 blockiert, wandert Sfp1 ins Zytoplasma, was zu einer verringerten Expression der ribosomalen Protein-Gene führt.

#Interaktion zwischen Sfp1 und NuA4

Während Sfp1 dafür bekannt ist, mit anderen Proteinen zu interagieren, arbeitet es auch eng mit einem Protein-Komplex namens NuA4 zusammen. Dieser Komplex enthält mehrere Untereinheiten, die helfen, die Struktur der DNA zu modifizieren, wodurch es einfacher wird, Gene zu aktivieren. Eine Möglichkeit, wie sie das tun, ist das Hinzufügen chemischer Gruppen zu Histonen, Proteinen, die bei der Verpackung von DNA in der Zelle helfen.

NuA4 ist besonders wichtig, da es die einzige essentielle Histon-Acetyltransferase in der Hefe enthält, die als Esa1 bekannt ist. Dieses Protein ist entscheidend für das Hinzufügen von Acetylgruppen zu bestimmten Histonen, was für die Regulierung der Genexpression wichtig ist. Forschungen haben gezeigt, dass NuA4 umfangreich an die Promotoren der ribosomalen Protein-Gene bindet und dass seine Assoziation anscheinend durch TORC1-Signale reguliert wird.

Angesichts der Rollen von Sfp1 und NuA4 bei der Regulierung der ribosomalen Protein-Gene war es wichtig zu verstehen, wie sie zusammenarbeiten. Um dies zu untersuchen, verwendeten die Forscher verschiedene Techniken in der Knollenhefe, um ihre Interaktionen zu analysieren.

#Experimentelle Beweise für die Interaktion

Die Forscher begannen damit, die physische Assoziation zwischen Sfp1 und NuA4 zu untersuchen. Sie verwendeten eine Methode namens Affinitätsreinigung, um Sfp1 zu isolieren und seine Interaktionspartner zu identifizieren. Sie fanden heraus, dass eine entscheidende Komponente von NuA4, bekannt als Tra1, in den Proben vorhanden war, in denen Sfp1 gereinigt wurde. Das bestätigte, dass Sfp1 physisch mit dem NuA4-Komplex interagiert.

Um tiefer zu graben, suchten sie auch nach spezifischen NuA4-Untereinheiten wie Eaf1 und Arp4 in den Sfp1-Proben, was die Interaktion weiter bestätigte. Selbst als der TORC1-Weg gehemmt wurde, hielt die Sfp1-NuA4-Interaktion an, was darauf hinweist, dass ihre Verbindung robust und unabhängig von den Nährstoffbedingungen ist.

Als Nächstes verwendeten sie eine Methode namens GST-Pulldown, um zu überprüfen, ob die Interaktion direkt zwischen Sfp1 und NuA4 stattfinden könnte. Sie zeigten, dass, als sie Sfp1 mit NuA4 vermischten, sie die Aktivität von NuA4 herabziehen konnten, was auf eine direkte Interaktion hindeutet.

#Sf1s Rolle in der Funktion von NuA4

Nachdem sie bestätigt hatten, dass Sfp1 und NuA4 interagieren, wollten die Forscher herausfinden, wie sich diese Beziehung auf die Genexpression auswirkt. Sie untersuchten, ob Sfp1 die Rekrutierung des NuA4-Komplexes zu den Promotoren der ribosomalen Protein-Gene beeinflusst. Um die Auswirkungen der Sfp1-Depletion auf das Wachstum zu minimieren, verwendeten sie eine Technik namens Anchor-Away, um Sfp1 schnell aus dem Kern zu entfernen.

Obwohl Sfp1-depletierte Zellen Wachstumsdefekte zeigten, fanden die Forscher heraus, dass die Bindung von NuA4 an die Promotoren ribosomaler Gene unverändert blieb. Selbst wenn sie Zellen verwendeten, die überhaupt kein Sfp1 hatten, beobachteten sie, dass NuA4 immer noch an diesen Promotoren vorhanden war. Das deutet darauf hin, dass Sfp1 keine direkte Rolle bei der Rekrutierung von NuA4 zu den Gen-Promotoren spielt.

#Auswirkungen der Sfp1-Depletion auf die Histon-Acetylierung

Während Sfp1 die Bindung von NuA4 an Promotoren nicht beeinflusst, wollten die Forscher als Nächstes sehen, ob Sfp1 eine Rolle in der Funktion von NuA4 spielt. Sie massen die Acetylierungsniveaus auf zwei wichtigen Histonen, H3 und H4, um herauszufinden, ob Sfp1 die Aktivität von NuA4 beeinflusst. Sie entdeckten, dass die Depletion von Sfp1 zu einem signifikanten Rückgang der Acetylierung beider Histone an den Promotoren der ribosomalen Protein-Gene führte. Das deutet darauf hin, dass NuA4 zwar weiterhin an diesen Regionen binden konnte, die Fähigkeit, Histone zu modifizieren, jedoch in Abwesenheit von Sfp1 eingeschränkt war.

Interessanterweise bemerkten sie auch, dass das Niveau von Htz1, einer Variante von Histon H2A, an den Promotoren ribosomaler Gene anstieg, als Sfp1 depletiert wurde. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Anwesenheit von Sfp1 die Acetylierung von Htz1 ebenfalls fördert, was entscheidend sein könnte, um zu regulieren, wann Gene aktiviert werden.

#Einfluss von NuA4 auf die Sfp1-Bindung

Da Sfp1 die Bindung von NuA4 nicht beeinflusst, aber dessen Funktion modulieren kann, untersuchten die Forscher, ob NuA4 Sfp1s Fähigkeit beeinflussen könnte, an die Promotoren der ribosomalen Protein-Gene zu binden. Wieder verwendeten sie die Anchor-Away-Technik, um schnell die Esa1-Untereinheit von NuA4 zu depletiert. Die Depletion von Esa1 reduzierte die Acetylierungslevels an den Promotoren ribosomaler Gene und beeinflusste die Sfp1-Bindung.

Als sie die Sfp1-Bindung über verschiedene Kategorien ribosomaler Protein-Gene analysierten, fanden sie heraus, dass die Rekrutierung in den Hauptkategorien ribosomaler Protein-Gene signifikant reduziert war, mit Ausnahme eines bestimmten Untersets. Das deutet darauf hin, dass NuA4 notwendig ist, um eine optimale Sfp1-Rekrutierung zu diesen Genen zu gewährleisten.

#Acetylierung von Sfp1

Neben Histonen kann NuA4 auch nicht-histonale Proteine modifizieren, einschliesslich Sfp1 selbst. Die Forscher identifizierten, dass Sfp1 an zwei bestimmten Lysin-Resten, K655 und K657, acetylieren kann. Um die Bedeutung dieser Acetylierungsstellen besser zu verstehen, schufen sie zwei Mutanten von Sfp1: eine, die nicht acetylierbar ist, und eine andere, die Acetylierung nachahmt.

Als die Forscher die Acetylierungslevels von Sfp1 untersuchten, stellten sie fest, dass Mutationen an K655 und K657 die Acetylierung von Sfp1 nicht vollständig eliminieren, was darauf hinweist, dass auch andere Stellen Zielstrukturen sein könnten. Interessanterweise bemerkten sie, dass die Acetyl-Nachahmer-Mutante eine erhöhte Sensitivität gegenüber Stress und Nährstoffmangel zeigte, was bedeutet, dass sie die Zell-Signalisierung über die Nährstoffverfügbarkeit möglicherweise fehlleitet.

#Auswirkungen der Acetylierung auf die Genexpression

Als Nächstes wollten sie sehen, wie die Acetylierung von Sfp1 seine Funktion als transkriptioneller Aktivator beeinflusst. Sie verglichen die Genexpresssionslevels gewisser ribosomaler Protein- und Ribosomen-Biogenese-Gene zwischen dem Wildtyp-Sfp1 und den Mutantenstämmen. Der Mutantenstamm, der die Acetylierung nachahmt, zeigte einen signifikanten Anstieg der Expression von Ribosomen-Biogenese-Genen, während die Expression der ribosomalen Protein-Gene stabil blieb.

Weitreichende RNA-Sequenzierung bestätigte, dass bestimmte Cluster von Genen, die mit der Ribosomenbiogenese in Verbindung stehen, im Acetyl-Nachahmer-Mutanat hochreguliert waren. Das deutet darauf hin, dass die NuA4-abhängige Acetylierung von Sfp1 einen signifikanten Einfluss auf seine Fähigkeit hat, die Genexpression zu regulieren.

#Auswirkungen von Kohlenstoffquellen auf die Genexpression

Die Forscher fanden heraus, dass die Art der verfügbaren Kohlenstoffquelle die Expression von ribosomalen Protein- und Ribosomen-Biogenese-Gene beeinflusste. Sie führten Experimente durch, bei denen Hefe in verschiedenen Kohlenstoffquellen gezüchtet wurde, und stellten fest, dass die Expression der ribosomalen Protein-Gene abnahm, als die Zellen von einer reichen Kohlenstoffquelle auf eine weniger günstige umgeschaltet wurden.

Als sie die Reaktion von Sfp1-Mutanten auf diese Veränderungen untersuchten, beobachteten sie, dass der Acetyl-Nachahmer-Mutant einen überraschenden Rückgang der Expression von Ribosomen-Biogenese-Genen unter nährstoffarmen Bedingungen hatte. Das deutet darauf hin, dass die regulatorischen Mechanismen von Sfp1 je nach Verfügbarkeit von Nährstoffen in der Umgebung unterschiedlich sein könnten.

#Glukose-Puls-Experimente

Um besser zu verstehen, wie Zellen Veränderungen in der Nährstoffverfügbarkeit wahrnehmen, entwarfen die Forscher ein Experiment, bei dem sie die Zellen von einer schlechten Kohlenstoffquelle auf eine reiche umschalteten. Sie wollten sehen, wie schnell und effektiv Zellen ihre Transkription als Reaktion auf den Nährstoffwechsel anpassen konnten.

Nachdem sie Glukose nach einer Periode in Raffinose eingeführt hatten, fanden sie heraus, dass sowohl Wildtyp- als auch Mutantenstämme einen Anstieg der Expression von ribosomalen Protein- und Ribosomen-Biogenese-Gene zeigten. Die Ergebnisse deuteten auf unterschiedliche Regulationsmechanismen für ribosomale Protein-Gene im Vergleich zu Ribosomen-Biogenese-Gene in Reaktion auf sich ändernde Nährstoffbedingungen hin.

#Fazit

Zusammenfassend beleuchtet diese Forschung, wie Sfp1 mit dem NuA4-Komplex interagiert, um die Expression von ribosomalen Protein- und Ribosomen-Biogenese-Genen zu regulieren. Die Anwesenheit von Sfp1 ist entscheidend für die lokale Histonmodifikation, die für eine ordnungsgemässe Genexpression notwendig ist, und während es die Bindung von NuA4 nicht beeinflusst, ist es entscheidend für die Acetyltransferase-Aktivität von NuA4.

Darüber hinaus hebt die Studie die Bedeutung der Acetylierung von Sfp1 hervor, um angemessene Reaktionen auf Nährstoffveränderungen auszulösen, wobei unterschiedliche regulatorische Mechanismen für ribosomale Protein- und Ribosomen-Biogenese-Gene wirken. Diese Arbeit zeigt eine komplexe Beziehung zwischen Transkriptionsfaktoren und Co-Aktivatoren, die bestimmt, wie Zellen sich an ihre Umgebung anpassen und ein angemessenes Wachstum und einen angemessenen Stoffwechsel sicherstellen. Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf breitere Diskussionen über die Genregulation und zelluläre Antworten und zeigen, dass die Art und Weise, wie Proteine interagieren und modifiziert werden, die zellulären Funktionen erheblich beeinflussen kann.