Kartierung der Verbindungen von Neuronen in Drosophila

Connectomics ist ein Bereich, der sich darauf konzentriert, die Verbindungen im Nervensystem abzubilden. Das Ziel ist es, besser zu verstehen, wie das Gehirn funktioniert und wie Unterschiede in der Gehirnstruktur das Verhalten und die Gesundheit beeinflussen können. Erste Studien haben sich auf einfachere Organismen wie den winzigen Wurm C. elegans konzentriert, bei dem Forscher die Verbindungen zwischen seinen 302 Neuronen abgebildet haben. Dieses Mapping hat zu neuen Erkenntnissen darüber geführt, wie diese Neuronen das Verhalten beeinflussen. Ähnliche Studien mit der Fruchtfliege Drosophila haben auch unser Verständnis ihrer Gehirnfunktionen, insbesondere wie Verbindungen in bestimmten Gehirnbereichen zum Lernen und Gedächtnis beitragen, verbessert.

#Die Herausforderungen der Elektronenmikroskopie

Die Elektronenmikroskopie (EM) war ein wichtiges Werkzeug in der Connectomics, hat aber ihre Einschränkungen. Erstens ist die Verarbeitung von EM-Daten zu einem Connectom ein arbeitsintensiver und zeitaufwändiger Prozess. Das bedeutet, dass die verfügbaren Connectome oft nur Momentaufnahmen des Gehirns zu einem bestimmten Zeitpunkt sind. EM kann nicht leicht die Unterschiede zwischen den Gehirnen verschiedener Tiere oder wie sich Verbindungen unter verschiedenen Bedingungen verändern, zeigen. Ausserdem übersieht EM bei Studien an Drosophila oft feine Verbindungen, was zu einer Unterzählung von Synapsen führt.

EM erfasst hauptsächlich chemische Synapsen, schliesst jedoch keine Verbindungen ein, die über Gap Junctions oder Neuromodulatoren hergestellt werden, die ebenfalls wichtig für die Gehirnfunktion sind.

#Genetische Methoden zur Abbildung von Verbindungen

Um die Schwächen der EM zu beheben, haben Forscher auf genetische Techniken zurückgegriffen, die ein schnelleres Mapping neuronaler Verbindungen ermöglichen. Eine solche Methode heisst GRASP. Diese Technik nutzt zwei nicht-fluoreszierende Teile eines Proteins (GFP), die in verschiedenen Neuronen exprimiert werden. Wenn sich zwei Neuronen verbinden, rekonstituieren sie das GFP, was zu Fluoreszenz führt. Diese Methode war effektiv, um neue Verbindungen zu identifizieren, wie z.B. die von bestimmten Neuronen, die die zirkadianen Rhythmen in Drosophila steuern.

Eine neuere Technik namens Trans-Tango ist ebenfalls aufgetaucht. Diese Methode erlaubt es, Verbindungen zwischen Neuronen auf einfachere Weise nachzuverfolgen. Bei Trans-Tango wird ein spezifischer menschlicher Ligand in ausgewählten Neuronen exprimiert, der dann an einen Rezeptor bindet, der im gesamten Nervensystem exprimiert wird. Diese Bindung aktiviert ein Reportergen, sodass die Forscher spezifische Verbindungen visualisieren können. Diese Methode war nützlich, um verschiedene Neuronentypen und ihre Verbindungen in Drosophila zu identifizieren und wurde kürzlich auch für den Einsatz in Zebrafischen angepasst.

#Untersuchung der s-LNv-Neuronen

Kleine laterale ventrale Neuronen (S-LNvs) sind entscheidend für die Regulierung der zirkadianen Rhythmen in Drosophila. Diese Neuronen sind an Verhaltensweisen beteiligt, die einem 24-Stunden-Zyklus folgen, wie Bewegung und Fressen. s-LNvs zeigen signifikante strukturelle Veränderungen basierend auf der Tageszeit, indem sie ihre Projektionen am Morgen erweitern und am Abend zurückziehen. Sie sind auch dafür bekannt, synaptische Verbindungen im Einklang mit diesem täglichen Zyklus zu bilden und zu brechen.

Um die Verbindungen der s-LNvs besser zu verstehen, haben die Forscher die Trans-Tango-Methode angewendet. Sie haben sie so modifiziert, dass nur adulte s-LNvs in den Experimenten berücksichtigt wurden und ein spezialisiertes Reportergen verwendet wurde, das bei der Zählung der Verbindungen hilft.

Die Ergebnisse zeigten, dass s-LNvs spärliche Verbindungen zu anderen Gruppen von Uhrneuron bilden. Die Forscher isolierten Neuronen, die mit s-LNvs verbunden waren, und sequenzierten deren RNA, um mehr über ihre Identität zu erfahren. Diese neue Methode, die Tango-seq genannt wird, zeigte, dass s-LNvs hauptsächlich mit einer spezifischen Teilmenge von Uhrneuronen, den CNMa-exprimierenden DN1p-Neuronen, und auch mit Kenyon-Zellen im Pilzkörper verbinden, der für Lernen und Gedächtnis wichtig ist.

#Wie Trans-Tango optimiert wurde

Um die s-LNv-Verbindungen zu identifizieren, verwendeten die Forscher zunächst einen genetischen Treiber namens Pdf-Gal4, der eine kleine Anzahl von Neuronen im Gehirn anvisiert. Diese Methode führte jedoch zu breiten Expressionsmustern, die möglicherweise auch Verbindungen umfassten, die während der Entwicklung gebildet wurden, anstatt die Verbindungen, die im erwachsenen Gehirn vorhanden sind. Um dies zu beheben, nutzten sie ein System, das eine zeitgesteuerte Genexpression mit Mifepriston ermöglicht, was half sicherzustellen, dass nur adulte Verbindungen abgebildet wurden.

Durch die Modifizierung des Ansatzes zur Nutzung eines nukleus-lokalisierten Reportergens konnten sie Neuronen effektiver visualisieren und zählen. Letztendlich fanden sie heraus, dass s-LNvs mit verschiedenen Uhrneuronen verbinden, aber die Anzahl der Verbindungen variierte erheblich zwischen verschiedenen Neuronentypen.

#Verbindungsprofile der s-LNvs

Es wurde festgestellt, dass s-LNvs mit mehreren Arten von Uhrneuronen verbinden, jedoch war diese Verbindung nicht einheitlich. Während s-LNvs konsequent mit bestimmten Neuronen wie DN2s verbunden waren, waren die Verbindungen zu anderen, wie DN3s, viel seltener. Das deutet darauf hin, dass es eine beträchtliche Variation gibt, wie diese Neuronen miteinander interagieren.

Die Variabilität der Verbindungen wirft auch Fragen auf, ob die Unterschiede auf biologische Variationen unter den einzelnen Fliegen oder technische Aspekte der Methoden zurückzuführen sind, die für das Mapping dieser Verbindungen verwendet wurden.

Die Forscher konzentrierten sich dann auf DN1p-Neuronen, um zu sehen, ob sie ähnliche spärliche Verbindungsprofile aufwiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass auch DN1p-Neuronen begrenzte Verbindungen zu anderen Uhrneuronen bildeten, was das Muster widerspiegelt, das bei s-LNvs zu sehen war.

#Verwendung von Tango-seq zur Neuronenidentität

Tango-seq ermöglichte es den Forschern nicht nur, die Verbindungen der s-LNvs zu kartieren, sondern auch die molekularen Identitäten der Zielneuronen zu erkennen. Nachdem die Neuronen, die mit s-LNvs verbunden waren, isoliert wurden, führten die Forscher eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung durch, um deren Transkriptionsprofile zu analysieren.

Aus der Analyse ergab sich, dass die Zielneuronen in unterschiedliche Cluster klassifiziert werden konnten, wobei jeder Cluster die Expression spezifischer Gene aufwies, die mit bekannten Neuronentypen assoziiert sind. Einige Cluster repräsentierten gut definierte Zelltypen, während andere Neuronen enthielten, die aufgrund ihrer geringen Häufigkeit oder schlechten Sequenzierungsqualität nicht vollständig klassifiziert werden konnten.

#Bestätigung der Neuronenverbindungen

Die Forscher hatten das Ziel, die durch Tango-seq identifizierten Verbindungen zu bestätigen, indem sie diese mit bestehenden Kenntnissen über neuronale Interaktionen verglichen. Frühere Studien hatten bestimmte Verbindungen dokumentiert, wie z.B. die zwischen s-LNvs und DN2-Neuronen, was eine Grundlage für die Validierung bot.

Durch das Co-Färben der Neuronen und das Untersuchen ihrer Verbindungen bestätigten die Forscher, dass s-LNvs bevorzugt mit CNMa-positiven DN1p-Neuronen verbinden. Diese Bestätigung war entscheidend, um die neuen Erkenntnisse als zuverlässige Ergänzung zum bestehenden Wissen über neuronale Konnektivität im Fliegengehirn zu etablieren.

#Einfluss struktureller Veränderungen auf die Konnektivität

Die Komplexität, wie neuronale Verbindungen über die Zeit hinweg variieren, wird durch die Herausforderung verstärkt, solche dynamischen Veränderungen in lebenden Subjekten zu visualisieren. Die Forscher untersuchten, ob das modifizierte Trans-Tango verwendet werden könnte, um Veränderungen in der Konnektivität während der täglichen Erweiterungs- und Rückzugszyklen der s-LNvs zu beobachten.

Um dies zu tun, wurden Fliegen unter konstanten Lichtbedingungen gehalten, was die normalen rhythmischen Veränderungen hemmte. Durch das Messen der Struktur der s-LNv-Projektionen stellten die Forscher fest, dass, wenn sie in diesem Zustand gehalten wurden, die Verbindungen zu DN1-Neuronen abnahmen, was darauf hindeutet, dass die natürlichen Rhythmen von Expansion und Kontraktion entscheidend für die Aufrechterhaltung der synaptischen Konnektivität sind.

Diese Erkenntnis deutete darauf hin, dass die von s-LNvs gebildeten Verbindungen nicht nur statisch sind, sondern abhängig vom aktuellen strukturellen Zustand der Neuronen Veränderungen unterliegen.

#Fazit und zukünftige Richtungen

Die Integration von anatomischen Daten mit Einzelzell-Sequenzierung stellt einen bedeutenden Fortschritt in unserem Verständnis von neuronalen Schaltkreisen im Gehirn dar. Die Forschung hob die Komplexität der s-LNv-Verbindungen hervor und brachte neue Erkenntnisse über ihre Interaktionen mit spezifischen Neuronentypen.

Dennoch bleiben viele Fragen unbeantwortet. Zum Beispiel verdienen die Mechanismen, wie bestimmte Verbindungen während täglicher Zyklen hergestellt und gebrochen werden, weitere Exploration. Ausserdem bleiben die funktionalen Implikationen dieser Verbindungen in Bezug auf Verhaltensweisen, die von zirkadianen Rhythmen beeinflusst werden, zu detaillieren. Zukünftige Studien, die die hier entwickelten Werkzeuge nutzen, werden entscheidend sein, um die Feinheiten der Gehirnkonnektivität und -funktion in Drosophila und darüber hinaus zu entschlüsseln.