Fortschritte in der gezielten Massenspektrometrie

Die Massenspektrometrie ist eine Technik, die genutzt wird, um die Zusammensetzung verschiedener Substanzen zu analysieren, indem man ihre Masse und die Menge ihrer Komponenten misst. Im Bereich der Proteomik, die sich mit dem Studium von Proteinen beschäftigt, ist die Massenspektrometrie zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Forscher der biomedizinischen Wissenschaften geworden.

#Der Wechsel von qualitativen zu quantitativen Messungen

Früher begannen Proteomik-Methoden oft mit wenig Verständnis für den Inhalt der Proben. Forscher entdeckten verschiedene Proteine und Peptide, als würden sie sie zum ersten Mal sehen. Erfolg wurde meistens daran gemessen, wie viele Proteine oder Peptide gefunden werden konnten, und nicht an der Genauigkeit der Messungen. Das führte dazu, dass Instrumente und Methoden zur Detektion möglicherweise nicht optimiert waren, um Unterschiede in den Probenkonzentrationen genau zu messen.

In den frühen Tagen, circa in den 1980ern und 1990ern, waren die gängigsten Geräte für die Massenspektrometrie 3D-Ionenfallen. Diese Geräte hatten Einschränkungen, wie die Anzahl der Ionen, die sie gleichzeitig analysieren konnten, was etwa 1000 war. Damals lag der Fokus mehr darauf, Proteine zu identifizieren, als ihre Mengen genau zu messen. Während einige Quantifizierungen mit Techniken wie spektraler Zählung gemacht wurden, war das aufgrund der Möglichkeiten der Geräte begrenzt.

Mit der Entwicklung der Technologie wurden 2D-lineare Ionenfallen eingeführt. Diese verbesserten Geräte konnten viel mehr Ionen verarbeiten und waren damit effektiver für den wachsenden Bedarf an besserer Quantifizierung. Zum Beispiel verbesserte das LTQ Velos, eine fortschrittliche Ionenfalle, die Fähigkeit, Ionen zu isolieren und effizienter zu analysieren, was entscheidend war, da neue, leistungsstärkere Ionenquellen verfügbar wurden.

Später kombinierten die Orbitrap Fusion Tribrid-Instrumente verschiedene Technologien, die schnellere und effizientere Analysen ermöglichten, einschliesslich nahezu sofortiger Isolation von Vorläuferionen. Diese Innovation führte zu einer signifikant besseren Nutzung der Ionenakkumulationsprozesse, was zu viel höheren Erfolgsraten bei der Analyse führte.

#Der Aufstieg der gezielten Experimente

In den frühen 2000ern begannen Wissenschaftler, die Wichtigkeit der Zielgerichtetheit spezifischer Proteine innerhalb einer Probe zu erkennen. Dieser Wechsel führte zur Entwicklung gezielter Massenspektrometrie-Assays, die eine zuverlässige Alternative zu traditionellen Methoden wie Immunassays in klinischen Laboren boten. Mit der Zeit erlangte die gezielte Proteomik Anerkennung und wurde sogar von einem führenden Journal zur „Methode des Jahres“ gekürt.

Eine wichtige Methode, die in dieser Zeit entstand, war das Selected Reaction Monitoring (SRM), das hauptsächlich mit dreifachen Quadrupol-Massenspektrometern durchgeführt wurde. Diese Methode wurde populär, weil die Geräte dafür bereits weit verbreitet in vielen Forschungslabors verfügbar waren und einen rigorosen quantitativen Ansatz boten, insbesondere in regulierten Umgebungen.

Im Laufe der Zeit begann das Parallel Reaction Monitoring (PRM), ein starker Konkurrent zum SRM zu werden. PRM vereinfachte den Prozess, indem es die Messung des gesamten Spektrums von Produktionen auf einmal ermöglichte, was den Forschern half, die Identität ihrer Proben zu bestätigen und gleichzeitig die Empfindlichkeit zu erhöhen.

#Herausforderungen bei der gezielten Proteomik

Trotz der Vorteile der gezielten Proteomik gab es dennoch Herausforderungen. Eine wesentliche Einschränkung war die Anzahl der Peptide, die gemessen werden konnten. Oft gab es einen Kompromiss zwischen der Anzahl der Analyten und der Qualität der Messungen. Um dem entgegenzuwirken, entwickelten Forscher die Data Independent Acquisition (DIA), die die Analyse vieler Peptide auf einmal ermöglichte, obwohl dies manchmal die Selektivität reduzierte.

Ein anderer Weg, um Messungen zu verbessern, war die Einbeziehung der Retentionszeitplanung, bei der jedes Zielpeptid über einen bestimmten Zeitraum überwacht wurde. Allerdings konnte dies aufgrund der unvorhersehbaren Natur chromatographischer Verschiebungen im Laufe der Zeit zu Ineffizienzen führen. Neueste Fortschritte haben gezeigt, dass mit Echtzeitanpassungen Geräte diese Verschiebungen effektiver handhaben konnten, was eine gezieltere Probenahme von Peptiden ermöglichte.

#Entwicklung gezielter Assays

Das Erstellen gezielter Assays war früher kompliziert. Es erforderte oft einen ersten Satz an Experimenten, um geeignete Peptide zu identifizieren, gefolgt von der Erstellung von Standards oder der Produktion von Proteinen zur Optimierung der Methoden. Die Logistik stellte ebenfalls eine Herausforderung dar, da es nicht einfach war, herauszufinden, welche Peptide aus einem riesigen Pool effektiv analysiert werden konnten.

Jüngste Entwicklungen haben den Prozess zur Erstellung gezielter Assays vereinfacht. Durch die Nutzung von Gasphasenfraktionen, die aus verschiedenen Experimenten stammen, konnten Forscher qualitativ hochwertige Datenbibliotheken aufbauen, die es später erleichterten, gezielte Analysen durchzuführen.

#Einführung des Stellar-Massenspektrometers

Die Einführung des Stellar-Massenspektrometers stellte einen bedeutenden Fortschritt in der gezielten Massenspektrometrie dar. Dieses Gerät verfügte über viele Funktionen früherer Modelle, legte aber einen stärkeren Fokus auf quantitative gezielte Analysen. Verbesserungen in Hardware und Software ermöglichten schnellere Akquisitionen und bessere Algorithmen, die den Prozess der gezielten Analyse effizienter machten.

Eine der Schlüsselfunktionen des Stellar MS war sein adaptives RT-System, das in Echtzeit auf Retentionszeitverschiebungen reagierte. Dadurch konnten dynamische Änderungen der Akquisitionszeiten basierend darauf, wie beschäftigt das System war, vorgenommen werden. Ausserdem wurde ein Tool namens PRM Conductor entwickelt, um die Erstellung gezielter Assays zu erleichtern, indem ein grosser Teil des Setups automatisiert wurde.

#Experimentelle Verfahren: Ein genauerer Blick

In Experimenten mit dem Stellar-Massenspektrometer bereiteten Forscher Kalibrierungskurven unter Verwendung spezifischer biologischer Proben vor, wie z.B. Hühnerplasma, das mit menschlichem Plasma gemischt wurde. Verschiedene Methoden wurden verwendet, darunter die Flüssigkeitschromatographie, die dabei hilft, die Mischung in ihre einzelnen Komponenten zur besseren Analyse zu trennen.

Das PRM Conductor-Tool, das zusammen mit dem Stellar-Massenspektrometer verwendet wurde, vereinfachte den Prozess der Erstellung gezielter Assays. Es filterte Transitionen, die spezifische Kriterien wie Signalstärke und Retentionszeit erfüllten, um effektive Assays für jedes Peptid zu erstellen.

#Ergebnisse der Experimente

Die Experimente zeigten vielversprechende Ergebnisse für das Stellar-Massenspektrometer, insbesondere im Vergleich zu traditionellen dreifachen Quadrupol-Massenspektrometern. Das neue Gerät wies eine signifikante Verbesserung sowohl bei den Quantifizierungs- als auch bei den Nachweisgrenzen für die Analyse von Plasma-Peptiden auf.

Zum Beispiel wurde in einem Experiment festgestellt, dass das Stellar eine niedrigere Grenze der Quantifizierung für Plasma-Peptide erreichte als die traditionellen SRM-Geräte. Ausserdem lagen die medianen Variationskoeffizienten, die die Zuverlässigkeit der Messungen anzeigen, gut innerhalb akzeptabler Bereiche.

Bei der Prüfung eines grossen Kits, das zur Quantifizierung von Hunderten von Plasmaproteinen entwickelt wurde, erwies sich das Stellar-Massenspektrometer als effektiv. Die medianen Punkte pro Peak, die die Anzahl der gesammelten Datenpunkte für jedes Peptid anzeigen, waren mehr als ausreichend, um die Anforderungen an die Analyse zu erfüllen.

#Die E. coli-Analyse

Ein Experiment zur Analyse von E. coli-Proteinen, die mit HeLa-Zellen gemischt wurden, zeigte die Effektivität der label-freien Quantifizierungsmethode. Dieser Ansatz ermöglichte es den Forschern, die Peptidmengen zu bewerten, ohne für jedes Produkt schwere Standards zu benötigen.

Die Analyse ergab Tausende von einzigartigen Peptiden, und die Ergebnisse zeigten, dass in verschiedenen Assays hohe Präzision aufrechterhalten wurde. Selbst unter schwierigen Bedingungen konnte das Stellar-Massenspektrometer zuverlässige Ergebnisse liefern und dabei eine riesige Anzahl von Peptiden in unterschiedlichen Proben messen.

#Injektionszeiten und Ionenmessung

Einer der entscheidenden Aspekte der gezielten Massenspektrometrie ist das Verständnis der Beziehung zwischen Injektionszeiten und der Anzahl der gemessenen Ionen. Das Stellar-Massenspektrometer verwendet ein automatisches Verstärkungskontrollsystem (AGC), um die Anzahl der Ionen in jedem Messzyklus zu optimieren.

Dieses System passt die Injektionszeiten basierend auf der Häufigkeit jedes Ziels effektiv an und stellt sicher, dass weniger häufige Ziele mehr Zeit für eine genaue Messung erhalten. Infolgedessen wurden höhere Genauigkeit und Sensitivität in mehreren Assays erreicht, was die Vorteile des Stellar-Instruments unter Beweis stellt.

#Zusammenfassung und Ausblick

Insgesamt zeigte das Stellar-Massenspektrometer signifikante Fortschritte in der gezielten Proteomik und verbesserte die Leistung in Bezug auf Empfindlichkeit und Effizienz im Vergleich zu traditionellen Methoden. Forscher beobachteten Verbesserungen bei den Grenzen der Quantifizierung und Nachweisbarkeit, was es zu einem wertvollen Werkzeug für die Hochdurchsatzanalyse macht.

In Zukunft gibt es Pläne, zusätzliche Fähigkeiten des Stellar-Massenspektrometers zu erkunden. Die vielseitige Natur der linearen Ionenfalle ermöglicht verschiedene Isolationstechniken, die die Selektivität verbessern könnten, während gleichzeitig ein hoher analytischer Durchsatz erhalten bleibt. Zukünftige Studien werden darauf abzielen, diese Techniken zu integrieren, um noch präzisere Messungen zu erzielen.

Zusammenfassend haben die Fortschritte in der Technologie und Software die gezielte Proteomik zugänglicher und effizienter gemacht und den Weg für umfassendere Studien in verschiedenen biologischen Bereichen geebnet. Ziel ist es, weiterhin Methoden zu entwickeln, die zuverlässige und empfindliche Messungen bieten, um den Forschern zu helfen, die komplexe Welt der Proteine und ihre Rollen in Gesundheit und Krankheit besser zu verstehen.