Fortschritte in der DNA-Sequenzierung für Lebensmittelsicherheit

Blattgemüse kann echt ernsthafte Gesundheitsprobleme verursachen. In den USA stammen fast die Hälfte der Ausbrüche, die mit einem schädlichen Bakterium namens Shiga-toxin-produzierenden Escherichia coli (STEC) in Verbindung stehen, von diesen grünen Sachen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass landwirtschaftliches Wasser eine mögliche Quelle für das Problem sein könnte. Momentan braucht die Food and Drug Administration (FDA) bei einem Ausbruch 2 bis 4 Wochen, um den Grund durch Labortests herauszufinden. Das ist wirklich wichtig, denn frisches Obst und Gemüse verdirbt schnell, weswegen schnellere Methoden zur Identifikation unsicherer Produkte nötig sind.

Um Ausbrüche nachzuverfolgen und zu verstehen, nutzt die FDA eine Technologie namens ganzes Genom-Sequencing (WGS) mit Geräten von Illumina. Die Methode von Illumina ist zwar genau, hat aber Schwierigkeiten mit kniffligen, sich wiederholenden Teilen des bakteriellen Genoms. Daher ergibt die Zusammenstellung des Genoms eines an einem Ausbruch beteiligten Bakterienstamms oft viele Stücke anstatt ein vollständiges Bild. Das kann dazu führen, dass wichtige Daten fehlen, wie zum Beispiel, ob das Bakterium gegen Antibiotika resistent ist.

Eine alternative Methode ist die Verwendung von Long-Read-Sequencing-Technologie von Oxford Nanopore Technologies (ONT). Diese Methode kann längere DNA-Abschnitte lesen, was hilft, die richtigen Bakterien schneller zu identifizieren. Frühere Versionen dieser Technologie hatten jedoch eine geringere Genauigkeit und waren für bestimmte Analysen nicht zuverlässig. Kürzlich hat ONT eine neue Methode namens Q20+ eingeführt, die eine höhere Genauigkeit und bessere Ergebnisse verspricht. Dieser Fortschritt könnte ONT zu einer besseren Option für die Reaktion auf Ausbrüche von lebensmittelbedingten Krankheiten machen.

Bevor wir ONT-Sequenzierung breiter einsetzen, müssen wir sicherstellen, dass die Qualität mit der von Illumina übereinstimmt. Eine Pilotstudie, die sich auf die neue Technologie von ONT konzentrierte, wurde durchgeführt, um die besten Kombinationen von Bibliotheksvorbereitungs-Kits und Sequenzierungsgeräten zu finden. Die FDA hat Richtlinien, die vorschreiben, dass bestimmte Dinge während dieser Art von Validierung überprüft werden müssen, einschliesslich der Verwendung bekannter Bakterienstämme und der Sicherstellung, dass die Ergebnisse sowohl zwischen verschiedenen Durchläufen als auch innerhalb desselben Durchlaufs zuverlässig sind.

#Studiendesign

Für diese Pilotstudie wurden fünf bekannte Bakterienstämme ausgewählt, die Lebensmittelvergiftungen verursachen können. Dazu gehören Salmonella enterica, Vibrio parahemolyticus, Shigella sonnei, Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae. Die Bakterien wurden im Labor gezüchtet und für Tests aufbewahrt.

#DNA-Extraktion

Um diese Stämme zu analysieren, wurde DNA mit zwei verschiedenen Methoden extrahiert. Die erste Methode verwendete eine Maschine, die eine schnellere Extraktion ermöglicht, aber DNA produziert, die leicht bricht. Die zweite Methode war manueller, lieferte jedoch hochwertige DNA. Die beiden Arten extrahierter DNA wurden dann mit zwei verschiedenen Bibliotheksvorbereitungs-Kits verwendet, um sie für die Sequenzierung vorzubereiten.

#Ganzes Genom-Sequencing

Die extrahierte DNA wurde mit einem Gerät von Oxford Nanopore sequenziert. Der Prozess umfasste das Durchlaufen der Proben durch zwei verschiedene Protokolle während der Sequenzierungsphase. Nachdem die Sequenzierung abgeschlossen war, wurden diejenigen Reads, die nicht einem bestimmten Qualitätsstandard entsprachen, entfernt. Die hochwertigen Reads wurden dann mit einer Software namens Flye zu vollständigen bakteriellen Genomen zusammengestellt.

Um die ONT-Ergebnisse zu vergleichen, wurden dieselben Bakterienstämme auch mit einem anderen Gerät, dem Illumina MiSeq, sequenziert. Die Illumina-Methode liefert hochwertige kurze Reads, die ebenfalls zur Vergleichszusammenstellung verwendet wurden.

#Datenanalyse

Nach der Sequenzierung war der nächste Schritt, die resultierenden Genomdaten zu analysieren. Jedes zusammengestellte Genom wurde auf die korrekte Identifizierung der Bakterienart überprüft. Dies wurde mit einem Tool namens Kraken 2 gemacht. Die Genauigkeit wurde gemessen, um sicherzustellen, dass die korrekte Art identifiziert wurde.

#Genotypisierung

Weitere Analysen umfassten die Identifizierung des Bakterietyps, seiner Antibiotikaresistenz und möglicher Virulenzfaktoren. Bestimmte Werkzeuge wurden verwendet, um diese Eigenschaften basierend auf den Daten der Genomsequenzierung zu analysieren und zu identifizieren.

#Phylogenetische Analyse

Die Beziehung zwischen verschiedenen Bakterienstämmen wurde mit einer Methode namens wgMLST bewertet. Diese Methode vergleicht zahlreiche Gene über die Bakterien, um zu sehen, wie eng sie verwandt sind. Ein phylogenetischer Baum wurde erstellt, um diese Beziehungen zu visualisieren.

#Ergebnisse

Die Studie hat gezeigt, dass beide DNA-Extraktionsmethoden gut funktionierten, obwohl es Unterschiede in der Qualität und Vollständigkeit der aus jedem Durchlauf erhaltenen Genome gab. Die meisten der zusammengestellten Genome waren vollständig und erholten über 99 % der erwarteten Gene.

#Leistung der ONT-Technologie

Die Q20+-Technologie von ONT lieferte hochwertige Ergebnisse. Bei der Artenidentifizierung betrug die Genauigkeit 100 %, was bedeutet, dass jeder getestete Stamm korrekt identifiziert wurde. Das Gleiche galt für die Identifizierung von Antibiotikaresistenzgenen und Virulenzfaktoren. Die ONT-Zusammenstellungen zeigten, dass sie bei der Analyse eng mit Referenzgenomen gruppiert waren, was auf eine zuverlässige Leistung hinweist.

#Beobachtungen zur Datenqualität

Obwohl die Gesamtleistung stark war, gab es einige Inkonsistenzen. Beispielsweise variierten bestimmte Assemblierungs-Längen signifikant zwischen verschiedenen Durchläufen. Einige fehlende Gene wurden bemerkt, und in einigen Fällen traten Probleme bei der Assemblierung auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ONT-Technologie zwar vielversprechend ist, aber möglicherweise weitere Optimierung für konsistente Ergebnisse über verschiedene Stämme benötigt.

#Auswirkungen auf die Lebensmittelsicherheit

Diese Forschung ist wichtig, weil sie die Notwendigkeit schnellerer Identifikationsmethoden für lebensmittelbedingte Krankheitserreger anspricht. Momentan ist die Zeit, die benötigt wird, um Ausbrüche zu identifizieren und zu lösen, eine grosse Herausforderung. Schnelle und genaue Methoden könnten den öffentlichen Gesundheitsbehörden helfen, effektiver zu reagieren und Gesundheitsrisiken im Zusammenhang mit kontaminierten Lebensmitteln zu minimieren.

Darüber hinaus könnte die Verwendung von ONT-Technologie ein echter Wendepunkt bei Ausbruchsuntersuchungen sein. Sie könnte einen effizienteren Ansatz im Vergleich zu den heute verwendeten traditionellen Methoden bieten. Indem die Zeit reduziert wird, die benötigt wird, um schädliche Bakterien zu identifizieren, könnten Reaktionen auf Lebensmittelsicherheitsprobleme schneller und effektiver werden.

#Fazit

Die Pilotstudie zeigt das Potenzial der ONT-Sequenzierungstechnologie als praktikable Alternative zu traditionellen Methoden zur Identifizierung von lebensmittelbedingten Krankheitserregern. Auch wenn es noch Herausforderungen gibt, um konsistente Ergebnisse zu erzielen, könnte die hohe Genauigkeit und Geschwindigkeit von ONT die Massnahmen zur Lebensmittelsicherheit erheblich verbessern. Zukünftige Studien sind notwendig, um diese Methoden zu optimieren und sie vollständig in die regelmässigen Überwachungs- und Reaktionsstrategien zu integrieren.

Stetige Verbesserungen in Sequenzierungstechnologien wie ONT werden entscheidend für die öffentliche Gesundheit sein. Sie versprechen nicht nur, die Reaktionen auf lebensmittelbedingte Ausbrüche zu verbessern, sondern auch das Gesamtverständnis von bakteriellen Krankheiten zu erweitern.