Optimierung der DNA-Extraktion aus Insektenexemplaren aus Museen

Museums haben oft Sammlungen voller Exemplare, die uns helfen können, mehr über Biodiversität zu lernen. Diese Sammlungen könnten in der Wissenschaft besser genutzt werden, da sie viele Exemplare mit klaren Namen und nützlichen Infos über ihre Umgebungen und Standorte im Laufe der Zeit enthalten. In letzter Zeit hat die Technologie es einfacher gemacht, diese Sammlungen zu digitalisieren und genetische Daten zu erzeugen, was sie noch wertvoller und leichter zugänglich macht.

Wissenschaftler können jetzt neue Methoden nutzen, um DNA aus alten Exemplaren zu gewinnen. Techniken wie die komplette Genomsequenzierung und andere sind gängiger geworden. Allerdings können diese Methoden teuer und zeitaufwendig sein. Das gilt besonders für Sammlungen von Wirbellosen, die oft die grössten und vielfältigsten Teile einer Museumssammlung ausmachen. Um diese Probleme anzugehen, gibt es einen grossen Bedarf an Methoden, die günstig sind und schnell viele Proben verarbeiten können, damit Forscher mehr Informationen aus diesen wertvollen Ressourcen sammeln können.

DNA-Barcoding ist eine beliebte Methode geworden, um von vielen Exemplaren schnell und günstig genetische Informationen zu bekommen. Diese Technik ist besonders effektiv, wenn sie mit Metabarcoding kombiniert wird, bei dem Wissenschaftler verschiedene Proben analysieren, einschliesslich Umwelt-DNA oder Inhalten aus Tierdärmen, um die Biodiversität zu verstehen. Diese Methode wurde genutzt, um viele Gruppen von Organismen zu studieren, die nicht gut verstanden sind, wie bestimmte Insektenarten und winzige Wasserlebewesen. Ein grosses Hindernis beim Metabarcoding ist jedoch, dass unvollständige Datenbanken es schwer machen, verschiedene Arten zu identifizieren. Das führt oft dazu, dass Proben aufgrund von DNA-Sequenzen in Gruppen eingeteilt werden, anstatt einzelne Arten zu identifizieren. Daher sind robuste DNA-Referenzbibliotheken entscheidend, die tatsächliche genetische Sequenzen mit verifizierten taxonomischen Identitäten verknüpfen, um ein klareres Bild von Gemeinschaften zu bieten.

Museums-Sammlungen sind hervorragende Ressourcen für den Aufbau dieser Referenzbibliotheken. Sie haben viele gut dokumentierte Exemplare, einschliesslich der Typen, die bei ihrer ersten Beschreibung verwendet wurden. Frühere Forschungen haben versucht, viele DNA-Barcodes aus Museumsexemplaren zu erzeugen. Einige grosse Projekte haben erfolgreich Zehntausende von Exemplaren sequenziert. Trotz erheblichem Fortschritt bleiben Herausforderungen bestehen, insbesondere bei der Kostensenkung und der Steigerung der Artenvielfalt, um es Wissenschaftlern einfacher zu machen, die Methode zu nutzen.

Der erste Schritt in jedem Projekt, das die Extraktion von DNA aus Museumsexemplaren umfasst, ist, die bestmögliche DNA-Qualität zu erhalten. Historische DNA ist jedoch oft beschädigt. Der Extraktionsprozess ist entscheidend, da die Erträge typischerweise niedrig sind. Ein häufig verwendetes Set zur DNA-Extraktion aus Museumsexemplaren ist das Qiagen DNeasy-Set, das ziemlich teuer ist. Ein kostengünstigerer Ansatz besteht darin, speziell entwickelte Platten für die DNA-Reinigung zu verwenden, aber selbst diese Methode verursacht erhebliche Kosten, wenn man alle Ausgaben betrachtet.

Eine potenzielle Lösung zur Kostensenkung besteht darin, eine Methode namens Single-phase Reverse Immobilization (SPRI) zu verwenden, die kleine magnetische Kügelchen nutzt, die effizient hochqualitative DNA aus Museumsexemplaren extrahieren können. Während diese Kügelchen normalerweise zur Auswahl und Reinigung von DNA-Sequenzierungsproben verwendet werden, können sie auch effektiv DNA extrahieren. Diese Methode nutzt Kügelchen, die an Nukleinsäuren binden, wenn sie mit Salz und Polyethylenglykol (PEG) in einer Lösung gemischt werden. Die Kügelchen werden dann mit einem Magneten von der Mischung getrennt, wodurch unerwünschte Materialien leicht entfernt werden können. Diese Methode erfordert nicht nur weniger Schritte als andere Extraktionstechniken, was die Wahrscheinlichkeit, die DNA zu beschädigen, verringert, sondern ist auch schneller und günstiger, wenn sie mit hausgemachten Lösungen durchgeführt wird.

#Forschungsfokus

Unsere Hauptfrage war, ob die SPIR-Kügelchen-Methode eine einfache, effiziente und kostengünstige Möglichkeit sein könnte, DNA aus verschiedenen Arten von Insektensammlungen in Museums-Sammlungen zu gewinnen. Um dies zu untersuchen, optimierten wir die Kügelchenlösungen und verglichen die Qualität der DNA, die mit unserer Methode extrahiert wurde, mit anderen gängigen Extraktionsprotokollen. Wir testeten unser Protokoll auch an zahlreichen Insektenexemplaren aus verschiedenen Gruppen, die auf unterschiedliche Weise konserviert und über mehrere Jahre gesammelt wurden.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Extraktionsmethode effektiv war, um hochqualitative DNA aus allen Arten von Proben zu erzeugen, wobei nur eine Stunde aktive Arbeit nach der Zelllyse benötigt wurde und die Kosten pro Probe nur 6–11 Cent betrugen, abhängig von der Exemplarart.

#Materialien und Methoden

Unser erstes Ziel war es, eine Lösung zu verfeinern, die die Menge der verwendeten Kügelchen minimiert, während sie immer noch effektiv kleine DNA-Fragmente bindet. Wir begannen mit einem einfachen Rezept, das magnetische Kügelchen, PEG und Salz enthielt. Dann begannen wir mit der Optimierung, indem wir die Konzentration von PEG anpassten. Wir wollten das Volumen der benötigten Kügelchen reduzieren und gleichzeitig die Fähigkeit bewahren, kleine DNA-Fragmente zu binden.

Wir testeten verschiedene PEG-Konzentrationen und Kügelchenverhältnisse, um die beste Kombination zu finden, um kleinere DNA-Fragmente zu behalten, ohne zu viele Kügelchen zu verwenden. Die Kügelchenlösung wurde auf Proben von verdünnten DNA-Leiter verwendet, um die Effektivität jeder Mischung zu bewerten. Nachdem wir die Proben eingerichtet und inkubiert hatten, entfernten wir den Überstand und führten Reinigungsschritte mit Ethanol durch, um sicherzustellen, dass die extrahierte DNA sauber war.

Anschliessend wendeten wir unsere optimierte Kügelchenmethode auf Museumsexemplare an. Wir testeten unterschiedliche Salzkonzentrationen in Kombination mit den Kügelchenlösungen, um zu evaluieren, wie gut sie Verunreinigungen in der extrahierten DNA reduzieren konnten. Nach sorgfältigen Anpassungen und dem Testen verschiedener Rezepte an einer Auswahl von Museumsexemplaren fanden wir die effektivste Methode, die zu hochqualitativen Extrakten führte.

Dann verwendeten wir eine Methode namens PCR, um zu sehen, wie gut die verschiedenen Extraktionsmethoden bei der Amplifikation von DNA-Sequenzen funktionierten. Dabei wurden spezifische Gene in den DNA-Proben angesteuert. Tests wurden mithilfe von Gelelektrophorese durchgeführt, um die Ergebnisse zu visualisieren und den Erfolg der Amplifikation zu bestimmen.

#Ergebnisse

Wir fanden heraus, dass unsere optimierte Extraktionsmethode erfolgreich war, hochqualitative DNA aus allen Arten von Insektensammlungen zu erzeugen. Fünf der vierundzwanzig Proben ergaben jedoch nicht genug DNA für eine ordnungsgemässe Bewertung. Für die verbleibenden Proben verwendeten wir statistische Modellierung, um zu verstehen, wie verschiedene Faktoren, wie Salzkonzentration und Probenalter, die DNA-Ausbeute und -Qualität beeinflussten.

Wir verglichen auch die Effektivität unserer kügelchenbasierten Extraktionsmethode mit anderen gängigen Extraktionskits, wie dem Qiagen DNeasy-Set. Während das DNeasy-Set die DNA von höchster Qualität produzierte, fanden wir heraus, dass unsere kügelchenbasierte Methode in Bezug auf die Amplifikation von DNA aus Proben vergleichbar gut abschneidet.

Ausserdem testeten wir unsere Methode an einer grossen Anzahl von Exemplaren und extrahierten erfolgreich DNA aus fast 3.800 Proben aus verschiedenen Ordnungen. Unsere Methode war besonders effektiv für nicht-destruktive Extraktionstechniken und erzielte hohe Ausbeuten aus ganzen Exemplaren, die einfach in einem Lysepuffer eingeweicht wurden, im Vergleich zu komplizierteren Extraktionsmethoden.

Schwarze Käfer und Fliegen gehörten zu den verschiedenen Arten, aus denen wir DNA extrahierten, wobei wir unterschiedliche Extraktionsmethoden anwendeten, darunter unser SPIR-kügelchenbasiertes Protokoll, Qiagens DNeasy-Methode und die HotShot-Methode. Während die DNeasy-Methode insgesamt die beste Leistung zeigte, bot unsere kügelchenbasierte Methode ein gutes Gleichgewicht zwischen Kosteneffektivität und Qualität für grössere Projekte.

#Optimierung der Kügelchenlösung

Unsere Studie zielte darauf ab, die Kosten im Zusammenhang mit grossangelegten Projekten zu senken und unsere Extraktionsmethoden zu optimieren. Eine der grössten Kosten stammt von den Kügelchen, die im Extraktionsprozess verwendet werden. Wir stellten fest, dass die Zubereitung von Kügelchenlösungen im Haus die Ausgaben im Vergleich zu kommerziellen Optionen erheblich senkte.

In unseren Experimenten entdeckten wir, dass die Konzentration von Chemikalien wie PEG und Salz entscheidende Rollen für den Erfolg der DNA-Reinigung spielte. Durch die Erhöhung der PEG-Konzentrationen konnten wir kleinere DNA-Fragmente behalten, selbst bei Verwendung von weniger Kügelchen, was wichtig ist, um die Gesamtkosten zu senken.

Als wir die Salzkonzentrationen variierten, erfuhren wir, dass niedrigere Werte zu höheren Qualitäts-DNA-Extrakten führten. Unsere besten Ergebnisse erhielten wir aus einer Kombination aus einem moderaten Kügelchenverhältnis und spezifischen PEG-Konzentrationen, was unseren Erfolg bei der Extraktion verwendbarer DNA erhöhte.

#Vergleich mit anderen Extraktionsmethoden

Nach der Feinabstimmung unserer Kügelchenlösung verglichen wir unsere Methode mit anderen beliebten Extraktionsmethoden. Das DNeasy-Set lieferte die höchste DNA-Konzentration, was auf niedrige Kontaminationslevels durch Proteine und andere Verbindungen hinweist. Diese Methode ist ideal für Projekte mit reichlich Finanzmitteln und weniger Proben, aber sie ist nicht praktikabel für grossangelegte Bemühungen.

Im Gegensatz dazu bietet unsere kügelchenbasierte Methode viele Vorteile für Hochdurchsatzprojekte. Unsere Methode schnitt gut ab, um grosse DNA-Fragmente zu halten, was die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation während der Tests erhöht.

Ausserdem stellten wir fest, dass während andere Methoden, wie HotShot, schneller und günstiger waren, sie oft zu niedrigerer DNA-Qualität und kleineren Fragmentgrössen führten. HotShot ist im Allgemeinen weniger geeignet für ältere Exemplare oder Studien, die hochwertiges genetisches Material benötigen.

#Hochdurchsatzpotenzial

Unsere Studie zeigte, dass es möglich ist, DNA aus verschiedenen Geweben effektiv unter Verwendung unserer optimierten Methode zu extrahieren. Durch die Anpassung bestimmter Faktoren, wie der Konzentration von Proteinase K und dem Volumen des Lysepuffers, konnten wir effizient DNA aus geringen Mengen Gewebe und sogar aus harten Exemplaren extrahieren.

Die Methode, die wir entwickelt haben, kann hochskaliert werden, um eine grosse Anzahl von Proben effizient zu verarbeiten. Mit halbautomatischen Werkzeugen haben wir Tausende von Exemplaren in kurzer Zeit verarbeitet. Die Einfachheit des Protokolls erlaubte eine schnelle und effektive Extraktion mit minimalem Aufwand.

Angesichts der niedrigeren Kosten, die mit unserer Methode verbunden sind, haben wir berechnet, dass es machbar sein könnte, DNA aus Zehntausenden von Museumsexemplaren für nur einen Bruchteil der aktuellen Kosten zu extrahieren.

#Fazit

Diese Studie hob das Potenzial unserer SPIR-kügelchenbasierten Extraktionsmethode als praktikable Lösung zur Extraktion von DNA aus Museumsexemplaren zu angemessenen Kosten und mit hoher Durchsatzrate hervor. Die anpassungsfähige Natur des Protokolls ermöglicht es, es für eine Vielzahl von Exemplaren zu verwenden, was es zu einem wertvollen Werkzeug für Forscher in Biodiversitäts- und Naturschutzfragen macht.

Unsere Methode geht auf viele der aktuellen Herausforderungen ein, denen das Feld gegenübersteht, darunter Kostenbeschränkungen und die Notwendigkeit einer qualitativ hochwertigen DNA-Extraktion aus vielfältigen Sammlungen. Während wir unseren Ansatz weiter verfeinern, hoffen wir, die laufenden Bemühungen zu unterstützen, die genetischen Informationen, die in Museumssammlungen gespeichert sind, zu erschliessen und damit die Forschung und den Naturschutz im Bereich der Biodiversitätswissenschaften voranzutreiben.