Neue Methode zeigt Proteinvariabilität und Funktion

Proteine sind essentielle Bestandteile lebender Zellen und spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen. Sie helfen bei Funktionen wie dem Aufbau von Zellstrukturen, der Informationsverarbeitung und dem Reagieren auf Signale. Jedes Protein funktioniert basierend auf seiner einzigartigen Form, die durch die Reihenfolge kleinerer Bausteine, den Aminosäuren, bestimmt wird. Änderungen in dieser Reihenfolge, bekannt als Mutationen, oder Modifikationen, die nach der Herstellung eines Proteins auftreten, können zu unterschiedlichen Formen desselben Proteins führen, den sogenannten Proteoformen. Diese Proteoformen können unterschiedliche Rollen im Körper haben.

#Die Bedeutung des Studierens von Proteoformen

Neueste Forschungen haben darauf abgezielt, die verschiedenen Proteoformen zu katalogisieren, die in spezifischen biologischen Kontexten vorhanden sind, wie zum Beispiel in verschiedenen Arten von Blutkörperchen. Dieser Aufwand könnte den Wissenschaftlern helfen, zu verstehen, wie bestimmte Proteine sich unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich verhalten. Hochmoderne Methoden wurden entwickelt, um diese Proteoformen zu identifizieren, aber einige Methoden sind aufgrund ihrer Komplexität und Unklarheit nicht weit verbreitet. Daher besteht die Notwendigkeit einfacher Ansätze, um diese Proteine und ihre Funktionen zu studieren.

#Ein neuer Ansatz zur Analyse von Proteinen

In diesem Artikel stellen wir eine neue Methode zur Erkennung verschiedener Proteinformen vor, die eine Technik namens Immunpräzipitation gefolgt von Massenspektrometrie (IP-MS) verwendet. Diese Methode konzentriert sich normalerweise darauf, die Proteine zu identifizieren, die mit einem spezifischen Zielprotein, dem sogenannten Bait-Protein, interagieren. Unser Ansatz verlagert den Fokus darauf, das Bait-Protein selbst und die verschiedenen Formen, die es unter verschiedenen Bedingungen annimmt, zu untersuchen, was wichtige Informationen enthüllen kann.

Durch die Erstellung eines Protokolls, das eine effiziente Erfassung des Bait-Proteins mit Antikörpern ermöglicht, können wir seine verschiedenen Versionen zuverlässiger analysieren. Diese Methode stellt sicher, dass wir sowohl die modifizierten als auch die unmodifizierten Formen des Bait-Proteins erkennen können, was zu besseren Einblicken darin führt, wie diese Proteine in verschiedenen biologischen Szenarien funktionieren.

#Analyse der HRAS-Proteine

Um unsere Methode zu demonstrieren, haben wir ein Protein namens HRAS untersucht. Wir analysierten Proben aus Zelllinien, die entweder das normale HRAS oder eine mutierte Version namens G12D exprimierten. Mithilfe unseres Ansatzes entdeckten wir viele verschiedene Formen des HRAS-Proteins. Wir fanden heraus, dass die Bait-Proteine in unseren Proben stark angereichert waren und wir fast alle Bait-Proteine erfassen konnten, was zu einer hohen Abdeckung führte.

Ausserdem identifizierten wir verschiedene modifizierte Formen eines spezifischen Peptidsegments im HRAS-Protein. Zum Beispiel wurde ein Peptidsegment in drei verschiedenen Formen gefunden: unmodifiziert, Modifiziert mit Carbamylierung und modifiziert aufgrund der G12D-Mutation. Die Fähigkeit, diese verschiedenen Formen zu erkennen, zeigt, dass unsere Methode die Veränderungen innerhalb des HRAS-Proteins effektiv erfasst.

Durch unsere Analyse zeigten wir auch, dass die modifizierten Formen des HRAS-Proteins nach Art der vorliegenden Mutation klassifiziert werden konnten. Diese Klassifizierung kann helfen zu verstehen, wie diese Veränderungen die Funktion des Proteins beeinflussen.

#Wechsel zu KRAS-Proteinen

Als nächstes wandten wir unsere Methode auf ein weiteres Protein namens KRAS an, insbesondere auf seine mutierte Version G12C. Neueste Fortschritte haben zur Entwicklung spezifischer Medikamente geführt, die auf KRAS G12C abzielen, aber es gibt Bedenken hinsichtlich der Entstehung von Resistenzen gegen diese Behandlungen. Wir untersuchten, wie sich das KRAS-Protein bei der Exposition gegenüber einem Medikament namens AMG-510 verändert.

Wieder bestätigten wir, dass unsere Methode effektiv funktionierte und hohe Mengen an KRAS-Proteinen in den behandelten Proben erfasste. Interessanterweise bemerkten wir einen Rückgang der Präsenz des KRAS-Proteins in Proben, die mit AMG-510 behandelt wurden. Diese Veränderung war mit der Hemmung der Fähigkeit des Proteins verbunden, auf das Enzym Trypsin zu reagieren.

Unsere Analyse zeigte, dass die behandelten KRAS G12C-Proben eine Verschiebung in den Arten der modifizierten Peptide aufwiesen, was darauf hindeutet, dass das Medikament erhebliche Veränderungen im Zustand dieses Proteins verursachte. Besonders bemerkten wir, dass spezifische Modifikationen an Cysteinpositionen im KRAS-Protein, die wichtig für seine Funktion sind, bei der Behandlung mit AMG-510 verändert wurden.

#Untersuchung der BRD4-Proteine

Um unsere Methode weiter zu validieren, schauten wir uns endogene BRD4-Proteine in verschiedenen Leukämiezelllinien an. Wir fanden heraus, dass BRD4 in allen Bedingungen angereichert war, ausser in Proben, die mit einer Kontrollsubstanz behandelt wurden. Durch den Vergleich der BRD4-Spiegel in verschiedenen Zelllinien bemerkten wir Unterschiede in ihrer Expression.

Unser Protokoll normalisierte effektiv die Mengen der Bait-Proteine, was faire Vergleiche zwischen den verschiedenen Zelllinien ermöglichte. Trotz einiger Herausforderungen aufgrund einer geringeren Proteinabdeckung in diesem Experiment konnten wir mehrere Formen von BRD4 identifizieren, die zwischen den Zelllinien K-562 und MOLM-13 variierten.

Interessanterweise wurde eine spezifische phosphorylierte Form eines BRD4-Peptids unterschiedlich exprimiert, was zeigt, wie unsere Methode wichtige Modifikationen selbst in Proteinen aufdecken kann, die natürlich in Zellen exprimiert werden.

#Fazit

Zusammenfassend ermöglicht unsere neue Methode Forschern, verschiedene Formen von Proteinen aus denselben Proben zu erfassen, was das Verständnis von Proteininteraktionen und -funktionen verbessern kann. Durch die Integration der Identifizierung modifizierter Proteine mit Studien über deren Wechselwirkungen mit anderen Proteinen können wir tiefere Einblicke in ihre biologischen Rollen gewinnen.

Obwohl unser Ansatz gut funktioniert, gibt es noch Verbesserungsmöglichkeiten. Die Verbesserung der Methoden zur Probenaufbereitung und die Reduzierung von Kontaminationen könnten zu zuverlässigeren Ergebnissen führen. Darüber hinaus sollten die Forscher beachten, dass bestimmte Modifikationen die Fähigkeit, Proteine effektiv zu erfassen, beeinflussen können.

Trotz dieser Herausforderungen bietet unsere Methode ein wertvolles Werkzeug, um die komplexe Welt der Proteine und ihre Funktionen zu erkunden, und ebnet den Weg für zukünftige Forschungen darüber, wie diese Moleküle in lebenden Organismen agieren.