Fortschritte bei der Erkennung von Protein-Protein-Interaktionen

Protein-Protein-Interaktionen (PPIS) sind super wichtig für viele biologische Funktionen. Sie helfen, verschiedene Prozesse in unseren Zellen zu steuern, wie zum Beispiel, wie Enzyme arbeiten und wie Zellen auf Signale von aussen reagieren. Wenn diese Interaktionen gestört sind, kann das zu Krankheiten wie Krebs und Stoffwechselstörungen führen. Deshalb ist es nicht nur für die Wissenschaft wichtig, PPIs zu finden und zu verstehen, sondern auch entscheidend für die Verbesserung von Diagnoseverfahren und Behandlungen.

Im Laufe der Jahre haben Wissenschaftler vor allem experimentelle Methoden verwendet, um PPIs in grossem Massstab zu identifizieren. Techniken wie Immunpräzipitation-Massenspektrometrie (IP-MS) und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening (Y2H) waren beliebt. Obwohl diese Methoden wertvolle Einblicke geliefert haben, haben sie auch ihre Einschränkungen. Zum Beispiel kann Y2H einige Interaktionen übersehen, was mehrere Tests zur Bestätigung der Ergebnisse erforderlich macht. Ähnlich repräsentieren die durch IP-MS gefundenen Interaktionen manchmal keine direkten Verbindungen zwischen Proteinen. Wegen dieser Herausforderungen müssen Wissenschaftler oft zusätzliche Experimente durchführen, um ihre Ergebnisse zu validieren.

#Aktuelle Fortschritte in der Proteinvorhersage

Kürzlich sind neue Methoden zur Vorhersage von Proteinstrukturen entstanden, wie AlphaFold und RoseTTAFold. Diese Technologien ermöglichen es Wissenschaftlern, vorherzusagen, wie Proteine sich falten und miteinander interagieren, und das mit grosser Genauigkeit. Unter diesen sticht AlphaFold-Multimer (AFM) hervor, da es Interaktionen zwischen Proteinpaaren vorhersagen kann, was einen bedeutenden Wandel in der Analyse von PPIs darstellt. AFM bietet nicht nur eine skalierbare Alternative zu traditionellen experimentellen Methoden, sondern kann auch einige ihrer inhärenten Herausforderungen angehen.

Seit seiner Einführung haben mehrere Forschungsgruppen daran gearbeitet, die Leistung von AFM zu verbessern. Sie konzentrierten sich darauf, wie PPIs genauer vorhergesagt und wie diese Vorhersagen bewertet werden können. Eine Herausforderung bei der computergestützten Vorhersage ist, dass sie manchmal ungenaue Ergebnisse liefern, da es Schwierigkeiten bei der Vorhersage von Proteinstrukturen gibt, besonders in flexiblen Regionen der Proteine. Diese flexiblen Bereiche sind oft dort, wo PPIs stattfinden.

Um dieses Problem zu lösen, erkannten Wissenschaftler die Notwendigkeit neuer Metriken, die direkte Interaktionen besser identifizieren können, besonders wenn Proteine flexible Teile haben. In dieser Studie wurde AFM angepasst, um bestehende experimentelle Daten effektiver zu analysieren und PPIs mit verbesserten Techniken zu identifizieren.

#Verbesserung der PPI-Erkennung mit AFM

In dieser Studie wurde AFM verwendet, um Datensätze aus hochkonfidenten PPIs neu zu analysieren. Das Team bewertete Datensätze von zwei Arten: Drosophila (Fruchtfliegen) und Menschen. Das Hauptziel war es, die Einschränkungen bei der Verwendung einer Metrik namens Interface pTM (ipTM) zur Identifizierung von PPIs zu ermitteln. Die Forscher fanden heraus, dass ipTM-Scores, die die Genauigkeit der vorhergesagten Proteinstrukturen messen, nicht immer echte Interaktionen anzeigen, insbesondere in Fällen mit kleineren und flexibleren Interaktionsstellen.

Um dies zu verbessern, entwickelten die Forscher ein neues Bewertungssystem namens Local Interaction Score (LIS). Diese neue Massnahme konzentriert sich auf Bereiche, in denen die Vorhersagen niedrigere Fehlerraten haben, was darauf hindeutet, dass diese Regionen dort liegen könnten, wo echte Interaktionen stattfinden. Mit diesem neuen Ansatz konnten die Forscher direkte PPIs in Datensätzen, die aus experimentellen Methoden wie IP-MS und Y2H stammen, effektiver identifizieren als allein mit AFM.

#Anwendung auf den Drosophila m6A Methyltransferase-Komplex

Als spezifischen Anwendungsfall wandten die Forscher die LIS-Technik an, um den m6A Methyltransferase-Komplex in Drosophila zu untersuchen. Sie konnten bekannte Komponenten dieses Komplexes rekonstruieren und sogar neue Interaktionen identifizieren, die zuvor nicht berichtet wurden. Dieser Ansatz führte zu über 5.000 vorhergesagten direkten PPIs, nachdem sie mehr als 30.000 potenzielle Interaktionen evaluiert hatten.

Das Team nutzte auch den LIS-Ansatz, um zusätzliche Signal- und Stoffwechselwege zu untersuchen und die Interaktionen basierend auf der bestehenden Literatur als potenziell oder bekannt zu kennzeichnen. Insgesamt untersuchten sie über 80.000 Proteinpaare und bereicherten die bestehende Datenbank von PPIs in Drosophila erheblich.

#Herausforderungen mit bestehenden Metriken

Die Forscher bemerkten mehrere Herausforderungen bei der Bewertung von PPIs mit den aus AFM abgeleiteten ipTM-Scores. Während diese Scores einige stabile Interaktionen erfolgreich vorhersagten, schafften sie es oft nicht, transientere und flexiblere Interaktionen zu identifizieren, die in physiologischen Umgebungen häufig vorkommen. Das Team stellte die Hypothese auf, dass die durch AFM erzeugten PAE (Predicted Aligned Error) Plots zusätzliche wertvolle Informationen für die Vorhersage von PPIs liefern könnten.

Durch die Analyse vorhandener positiver und negativer Kontroll-Datensätze zeigten die Forscher, dass die ipTM-Scores zwar effektiv zwischen bekannten Interaktionen und zufälligen Paaren unterschieden, aber oft mehrere bedeutende Interaktionen mit niedrigen ipTM-Scores, aber hohen LIS-Werten verpassten. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass strukturelle Genauigkeit allein möglicherweise nicht ausreicht, um die Komplexität echter Proteininteraktionen zu erfassen.

#Entwicklung des Local Interaction Score (LIS)

Um die Informationen in den PAE-Karten zu nutzen, hoben die Forscher Bereiche mit niedrigen Fehlerraten hervor und schufen ein Bewertungssystem basierend auf diesen Bereichen. Sie testeten verschiedene Grenzwerte für PAE, wobei ein Grenzwert von 12 die beste Fähigkeit zeigte, positive Interaktionen von negativen zu unterscheiden. Die neue LIS-Metrik übertraf bestehende Metriken erheblich in Bezug auf Sensitivität und Spezifität bei der Vorhersage von PPIs in ihren Experimenten.

Die Ergebnisse bestätigten, dass das neue LIS effektiv direkte Interaktionen zwischen Proteinpaaren identifizierte, insbesondere solche, die flexible Regionen betreffen. Diese Verbesserung ermöglicht es Forschern, PPIs zu erkennen, die traditionelle strukturbasierte Metriken möglicherweise übersehen würden.

#Weitere Validierung mit anderen Datensätzen

Die Forscher wandten ihre Methode auf zusätzliche Datensätze von Hefe und literaturkuratierten Proteinen an, um den LIS-Ansatz weiter zu validieren. Sie verglichen die Ergebnisse ihres Verfahrens mit etablierten Metriken und fanden heraus, dass der LIS konsequent die signifikantesten Unterschiede zwischen positiven und negativen Interaktionen lieferte. Besonders betont wurde die Fähigkeit, Interaktionen unter Proteinen, die auf kleineren Interfaces basieren, vorherzusagen.

#Sequenzielle AFM-Screenings zur Erweiterung von PPI-Netzwerken

Die Forscher implementierten auch einen mehrstufigen Screening-Prozess, der es ihnen ermöglichte, ein umfassenderes Netzwerk von Interaktionen basierend auf ihren Erkenntnissen aufzubauen. Durch die Verwendung der LIS- und PAE-Metriken in dieser iterativen Analyse konnten sie Interaktionen filtern und direkte Verbindungen zwischen Proteinen innerhalb eines zuvor charakterisierten Interaktoms identifizieren.

Ihr Screening durch den m6A-Komplex lieferte Einblicke sowohl in bekannte Interaktionen als auch in potenziell neue Verbindungen, die künftige experimentelle Arbeiten informieren könnten. Dieser Ansatz betont den Wert der Integration von computergestützten Vorhersagen mit experimentellen Daten, um unser Verständnis von Proteininteraktionen zu verbessern.

#Analyse von grossangelegten Drosophila PPI-Datensätzen

Um die Fähigkeiten des LIS-Ansatzes weiter zu demonstrieren, analysierten die Forscher grossangelegte Datensätze von Drosophila. Sie bewerteten den FlyBi-Datensatz und fanden heraus, dass ein signifikanter Prozentsatz der identifizierten Interaktionen ihre Schwellenwerte für die Klassifizierung als direkte Interaktionen erfüllte. Bei ähnlichen Evaluierungen von hochdurchsatz-IP-MS-Datensätzen fanden sie einen vergleichsweise niedrigeren Prozentsatz an direkten Interaktionen, was die Idee bestätigt, dass Y2H-Daten möglicherweise zuverlässiger sind, um echte PPIs zu identifizieren.

Die Studie zeigte auch die Effektivität der LIS-Methode bei der Aufdeckung positiver Interaktionen, die zuvor von traditionellen Metriken mit niedrigen Scores bewertet worden waren. Diese Entdeckung hebt die Fähigkeit der neuen Methode hervor, nuancierte und potenziell transientere Interaktionen zwischen Proteinen zu erfassen.

#Einführung in die FlyPredictome-Datenbank

Um Forschern den Zugang und die Nutzung der PPI-Vorhersagen aus ihrer Studie zu erleichtern, entwickelten die Wissenschaftler die FlyPredictome-Datenbank. Diese Online-Plattform dient als zentrale Anlaufstelle für Protein-Protein-Interaktionsvorhersagen in Drosophila und bietet eine benutzerfreundliche Schnittstelle zum Suchen und Abrufen relevanter Daten. Die Datenbank umfasst mehr als 80.000 PPI-Vorhersagen, sodass Nutzer verschiedene Proteininteraktionen entsprechend ihren experimentellen Bedürfnissen erkunden können.

Die FlyPredictome bietet nicht nur vorhergesagte Interaktionen, sondern auch Details zu Genexpressionsmustern, subzellulärer Lokalisation und Proteinstrukturvorhersagen. Forscher können diese Datenbank nutzen, um die biologische Relevanz der vorhergesagten Interaktionen zu bestätigen und Experimente zu entwerfen, die diese Interaktionen genauer testen.

#Fazit

Während die Forscher weiterhin die komplexe Welt der Proteininteraktionen erkunden, stellt die Einführung des Local Interaction Score einen bedeutenden Fortschritt in diesem Bereich dar. Durch das effektive Erfassen von Interaktionen, die auf flexiblen Regionen und lokalen Interfaces basieren, verbessert der LIS-Ansatz die Fähigkeit der Wissenschaftler, die komplexen Dynamiken von Proteininteraktionen in lebenden Organismen zu verstehen.

Durch die Kombination von computergestützten Vorhersagen und experimenteller Validierung ebnet die Studie den Weg für zukünftige Forschungen, die darauf abzielen, die Komplexität biologischer Funktionen, die von Protein-Protein-Interaktionen gesteuert werden, zu entschlüsseln. Die Einrichtung von Ressourcen wie FlyPredictome wird weiter zu diesem Ziel beitragen, so dass mehr Forscher auf diese Erkenntnisse zugreifen und darauf aufbauen können in dem fortlaufenden Bestreben, Biologie auf molekularer Ebene zu entschlüsseln.