真菌プラスミド技術の進展
改良されたプラスミドに関する研究が、真菌の遺伝子発現と天然物の産出量を向上させてるよ。
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菌類、カビや酵母を含む生物の一種は、バイオテクノロジーで重要なんだ。彼らは酵素や酸など、いろんな有用な物質を生産できて、さまざまな産業で使われてるよ。菌類のミコリウム(地下で成長する部分)は、材料作り、汚染の浄化、植物素材の加工、さらには食べ物としても使えるんだ。
いろんな菌類の中で、アスペルギルス属が最もよく研究されていて、利用されてるんだ。科学者たちは特に新しい薬の源として菌類に興味を持ってる。すでにいくつかの知られた化合物が菌類から得られるけど、医療的な利点がある未発見の化合物もたくさんあるんだ。
菌類には、さまざまな酵素をコードするユニークな遺伝子があって、その中には植物素材を燃料に変えるプロセスに使えるものもあるんだ。菌類の中でも、種によっても酵素や化合物の種類は全然違うよ。
菌類利用の課題
これらの菌類を研究する上での課題の一つは、実験室で育てにくいものもあるってこと。だから、彼らの潜在的な利用法は主に未知のままなんだ。それらが生産する酵素をよく理解するために、科学者たちはよく他の扱いやすい菌類に遺伝子を移すんだ。アスペルギルス・ニドゥランスがよく使われるホストなんだよ。
遺伝子を移すとき、科学者たちは直接菌類のDNAに結合させるか、プラスミドという環状のDNAを使うことがあるんだ。独立して複製できるプラスミドが好まれる理由は、より高い遺伝子発現を可能にするから。でもプラスミドの欠点は、細胞分裂の際に失われることがあって、結果が不安定になることなんだ。
遺伝子発現の改善
プラスミドを介して導入された遺伝子が菌類に保持されるように、研究者たちは厳しい選択基準を設ける方法に取り組んでる。これには、プラスミドをうまく取り込んだ菌類を特定するためのマーカーを使うことが含まれるんだ。一般的に使われるマーカーはpyrGで、特定の栄養素なしで成長できる菌類を選ぶのに役立つんだ。
でも、時間が経つと菌類はこれらのプラスミドを失うことがあって、その効果が減少するんだ。一つの理由は、ある細胞がプラスミドを保持せずに生き残って成長できるからかもしれない。これを「ズル」と呼ぶこともあるよ。もし細胞が栄養を共有し始めると、全体の集団の中でプラスミドの数が減ってしまうことがあるんだ。
この問題に対処するために、研究者たちはベーカリー酵母で使われている方法からヒントを得たんだ。マーカー遺伝子の発現を制限することで、より高いプラスミドレベルを維持するのに役立つことがわかったんだ。このアプローチは、pyrGマーカーとマーカープロテインの分解を促進するタンパク質タグを組み合わせた新しいプラスミドの開発につながったの。こうすることで、研究者たちはより効果的な遺伝子発現システムを作れることを期待してたんだ。
新しいプラスミドのテスト
新しく作られたプラスミドは、特に複数の遺伝子を発現させる必要がある場合に、菌類でよりよく機能するように設計されてるんだ。研究者たちは、この改良されたプラスミドを蛍光タンパク質を作る遺伝子と統合してテストしたんだ。これにより、新しいプラスミドの効果を視覚的に確認し、定量化できたんだ。
観察結果によると、新しいプラスミド、特に最も強力な分解タグを持つものは、菌類コロニーで均一で明るい蛍光を示したんだ。古いプラスミドと比べて、新しいバージョンは蛍光タンパク質の発現レベルが明らかに増加してたよ。
蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーによると、新しいプラスミドを発現している菌類は、蛍光レベルがかなり高くて、プラスミドを保持し、望ましいタンパク質を発現するのが成功してることを意味してるんだ。
でも、こうしたポジティブな結果にもかかわらず、新しいプラスミドは古いバージョンと比べて固体培地での成長率が低下したんだ。この遅い成長は、新しいプラスミドが遺伝子を保持するのに効果的ではあるけど、菌類に対してストレスをかけてるかもしれないってことを示唆してるんだ。
菌類でのCRISPRツールの使用
これらの改良されたプラスミドのもう一つの興味深い応用は、CRISPR技術の使用だよ。CRISPRは遺伝子を正確に編集できるから、特定の遺伝子を活性化するのが容易になるんだ。この場合、研究者たちは新しいプラスミドを通してCRISPR成分の輸送を改善しようとしてたんだ。
この新しいプラスミドを使用することで、CRISPRに必要なガイドRNAの輸送がかなり改善されたんだ。これにより、より多くのターゲット遺伝子が活性化できて、菌類が作り出す自然製品を探索するのに役立つんだ。
いくつかのプラスミドはバイオマス生産の面ではあまりうまくいかなかったけど、より強い選択マーカーを持つプラスミドは自然製品生産で有望な結果を示したの。この発見は、進化したプラスミドが菌類によって生産される化合物の収量を高める可能性があることを示してるんだ。
自然製品の収量向上
自然化合物の生産を増やす目標で、研究者たちは新しいプラスミドを使って、これらの化合物を作る特定の遺伝子にリンクさせて使ったんだ。小規模な培養を可能にする方法を利用して、改良されたプラスミドを使うことで、特定のメタボライトの生産を大幅に増やせることがわかったんだ。
具体的には、抗真菌特性がある可能性を持つネオアスペルギル酸の収量が、新しいプラスミドを使った時にかなり高くなることがわかったんだ。この結果は、菌類の遺伝子を最適化することで、貴重な化合物の生産をより良くできるってことを示唆してるよ。
要するに、新しいプラスミドは自然製品の量を増やすだけじゃなく、研究者たちがプロセスを合理化して、より効率的にできるようにしたんだ。これは、これらの化合物を医療などの実用的な用途に活用しようとする産業にとって特に役立つんじゃないかな。
結論
菌類に対するプラスミド技術の進展は、さまざまな用途のためにこれらの生物を利用する能力を大いに向上させる可能性があるんだ。厳格な選択マーカーと分解タグを組み合わせた次世代のAMA1プラスミドの開発は、有望な結果を示してるよ。より安定した遺伝子発現を確保し、貴重な化合物の生産を改善することで、これらの新しいツールは菌類の理解を深め、バイオテクノロジーへの利用を強化することができるんだ。
これらのプラスミドの研究は、研究や産業のために菌類を利用する上で重要な一歩を示してて、重要な生物材料を生産する能力を示してる。これらのシステムのさらなる探求と最適化が続けば、特に医療や環境科学の分野で人間に利益をもたらす方法がさらに広がるだろうね。
タイトル: Next generation AMA1-based plasmids for enhanced heterologous expression in filamentous fungi
概要: Episomal AMA1-based plasmids are increasingly used for expressing biosynthetic pathways and CRISPR/Cas systems in filamentous fungi cell factories due to their high transformation efficiency and multicopy nature. However, gene expression from AMA1 plasmids has been observed to be highly heterogeneous in growing mycelia. To overcome this limitation, here we developed next-generation AMA1-based plasmids that ensure homogenous and strong expression. We achieved this by evaluating various degradation tags fused to the auxotrophic marker gene on the AMA1 plasmid, which introduces a more stringent selection pressure throughout multicellular fungal growth. With these improved plasmids, we observed in Aspergillus nidulans a 5-fold increase in the expression of a fluorescent reporter, a doubling in the efficiency of a CRISPRa system for genome mining, and a up to a 10-fold increase in the production of heterologous natural product metabolites. This strategy has the potential to be applied to diverse filamentous fungi.
著者: Yit-Heng Chooi, I. Roux, C. Woodcraft, N. Sbaraini, A. Pepper, E. Wong, J. Bracegirdle
最終更新: 2024-08-17 00:00:00
言語: English
ソースURL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.01.596972
ソースPDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.01.596972.full.pdf
ライセンス: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
変更点: この要約はAIの助けを借りて作成されており、不正確な場合があります。正確な情報については、ここにリンクされている元のソース文書を参照してください。
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