Fortschritte in der Kontrolle der Genexpression mit synthetischen Promotoren

Die Kontrolle der Genexpression ist ein zentraler Teil der modernen Biologie. Mit bestimmten DNA-Abschnitten, die Promotoren genannt werden, können Wissenschaftler die Produktion von Proteinen in Organismen erhöhen oder verringern. In der Hefezelle, einem gängigen Modellsystem für die Forschung, wurden verschiedene Promotoren entwickelt. Einige dieser Promotoren stammen von natürlichen Genen, andere werden in Labors hergestellt. Jeder Promotor hat seine eigenen Eigenschaften, darunter, wie viel Protein er produzieren kann und wie er durch verschiedene Signale wie Temperatur, Medikamente oder Licht gesteuert werden kann.

#Arten von Promotoren

Es gibt zwei Haupttypen von Promotoren:

1. Konstitutive Promotoren, die Gene immer gleichmässig unabhängig von den Bedingungen exprimieren.
2. Kontrollierbare Promotoren, die je nach Umgebung ein- oder ausgeschaltet werden können.

Bei der Verwendung von kontrollierbaren Promotoren müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden:

• Steuerungsmethode: Wie der Promotor aktiviert wird (zum Beispiel durch Licht oder Chemikalien).
• Kontrollierbarkeit: Mass dafür, wie genau der Promotor zwischen ein und aus umschalten kann.
• Bequemlichkeit: Ob andere Komponenten, die zur Aktivierung des Promotors benötigt werden, bereits in der Hefe vorhanden sind.

Beispiele für gängige Promotoren in Hefe sind der TDH3-Promotor, der stark ist, und der GAL1-Promotor, der auf Zuckergehalte reagiert.

#Synthetische Promotoren

In letzter Zeit gab es Fortschritte in der Schaffung synthetischer Promotoren. Diese neuen Promotoren ermöglichen eine genauere Kontrolle der Proteinproduktion. Zum Beispiel integriert ein System namens WTC846 einen speziellen Bereich, der auf Tetracyclin reagiert. Das bedeutet, dass Forscher die Expression von Genen mit grosser Genauigkeit steuern können.

Eine weitere interessante Entwicklung ist das Z3EV-System, das ein synthetisches Protein enthält, das den Promotor aktivieren kann, indem es sich an einen bestimmten Bereich der DNA bindet, wenn es einem Medikament namens β-Östradiol ausgesetzt wird. Dieses System zielt darauf ab, Proteine zu produzieren, ohne unerwünschte Nebenwirkungen durch falsche Expression zu verursachen.

#Ziele der Studie

In der beschriebenen Forschung war das Ziel, einen neuen Promotor zu schaffen, der die Expression von Proteinen in Hefe maximiert. Frühere Arbeiten verwendeten den TDH3-Promotor, hatten jedoch einige Einschränkungen. Daher konzentrierten sich die Forscher darauf, sicherzustellen, dass der neue Promotor:

1. Die höchstmögliche Aktivität zur Aktivierung der Genexpression hat.
2. Nicht die Expression anderer natürlicher Gene in der Hefe stört, insbesondere wenn er auf mehreren Kopien eines Plasmids platziert wird.
3. Keine unerwünschten Proteine aufgrund einer zufälligen Aktivierung produziert.
4. Gut über verschiedene Wachstumsphasen hinweg funktioniert und auch dann effektiv bleibt, wenn Glukose die Hauptenergiequelle ist.

Um dies zu erreichen, entschieden sie sich, mit dem Z3EV-System-Promotor zu arbeiten, der gut auf β-Östradiol reagiert.

#Konstruktion des neuen Promotors

Der Z3EV-System-Promotor ist vom GAL1-Promotor modifiziert. Er verwendet den synthetischen Transkriptionsfaktor Z3EV, der die Genexpression aktiviert, wenn β-Östradiol vorhanden ist. Da er synthetisch ist, wird erwartet, dass er weniger Probleme verursacht, weil er nicht mit anderen Faktoren in der Hefezelle konkurriert.

Die Forscher waren der Meinung, dass eine Erhöhung der Anzahl der Bindungsstellen für Z3EV auf diesem synthetischen Promotor dessen Effektivität steigern würde. Sie testeten verschiedene Versionen des Promotors, jede mit einer unterschiedlichen Anzahl von Z3EV-Bindungsstellen.

#Ergebnisse des neuen Promotors

Sie fanden heraus, dass sie durch das Hinzufügen von bis zu 12 Bindungsstellen die Stärke des Promotors erheblich steigern konnten. Es wurde beobachtet, dass diese neue Version die Proteinexpression etwa 1,43-mal mehr als der TDH3-Promotor und 1,25-mal mehr als der vorhandene P3-Promotor erhöhte. Allerdings führte das Hinzufügen zu vieler Bindungsstellen zu einer Verringerung der Ausdrucksstärke, wahrscheinlich weil sie zu nah beieinander lagen und sich gegenseitig beeinflussten.

Bei der Verwendung dieses neuen Promotors in einem System, das mehrere Kopien von Plasmiden erlaubt, konnte die Hefe eine beträchtliche Menge an fremdem Protein exprimieren. In bestimmten Experimenten gelang es den Forschern, fast 50% des Gesamtproteins als gewünschtes Protein auszudrücken, was zeigt, dass dieses neue System für verschiedene Forschungsanwendungen genutzt werden könnte.

#Bewertung der Promotorstärke und Vergleich mit TDH3

Um die Stärke des neuen Promotors zu überprüfen, verglich das Team ihn mit dem TDH3-Promotor. Sie verwendeten ein wenig toxisches fluoreszierendes Protein, um zu messen, wie viel Protein unter verschiedenen Bedingungen produziert wurde. Der neue Promotor zeigte eine signifikante Steigerung der Proteinmenge, wenn er induziert wurde, und war in der Lage, Wachstumsraten ähnlich wie der TDH3-Promotor zu erreichen.

Zusammenfassend bestätigten die Ergebnisse, dass der neue P36-Promotor nicht nur gleichwertig, sondern in bestimmten Bedingungen sogar effizienter als der TDH3-Promotor war.

#Beobachtungen zur Leckage-Expression

Ein Punkt von Interesse bei dem neuen Promotorsystem war die "Leckage", was bedeutet, dass selbst ohne β-Östradiol einige Gene exprimiert wurden. Die Forscher bemerkten, dass eine Erhöhung der Anzahl der Bindungsstellen auch zu mehr Leckage führte, aber sicherstellten, dass die Expression bei Induktion ebenfalls erheblich ansteigen konnte.

#Expression von Zielproteinen

Aufbauend auf den Ergebnissen testeten die Forscher, ob mit dem neuen P36-Promotor noch höhere Proteinmengen produziert werden könnten. Frühere Studien hatten gezeigt, dass eine spezielle Version des grünen fluoreszierenden Proteins (mox-YG) hohe Expressionsniveaus erreichen konnte. Tests bestätigten, dass bei Verwendung des P36-Promotors die Expression von mox-YG im Vergleich zum TDH3-Promotor erhöht wurde, was die Ergebnisse über die Stärke des Promotors untermauerte.

Während der Wachstumsphase wurde festgestellt, dass mit steigender Expression von mox-YG die allgemeine Wachstumsrate der Hefe abnahm. Interessanterweise blieben die Gesamtproteinmengen stabil, trotz der scheinbaren Belastung durch die Produktion einer grossen Menge eines Proteins.

#Fazit zur Proteinbelastung

Die Forschung hebt eine kritische Beziehung zwischen erhöhter Proteinexpression und verringerten Wachstumsraten hervor. Diese Beziehung wurde sowohl bei Bakterien als auch bei Hefe beobachtet.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Hefezellen höhere Mengen an überschüssigen Proteinen tolerieren können, ohne sofort negative Auswirkungen auf ihr Wachstum zu haben, verglichen mit Bakterien. Der P36-Promotor dient als effektives Werkzeug für Wissenschaftler, um die Auswirkungen der Proteinproduktion auf die Zellphysiologie zu untersuchen und Einblicke in das Gleichgewicht zwischen Proteinfunktion und Zellwachstum zu gewinnen.

Durch diese Studie zeigen die Ergebnisse, dass das neue synthetische Promotersystem vielversprechend für zukünftige Forschung und Anwendungen im Bereich der Biotechnologie und Proteinengineering ist.

#Weitere Anwendungen

Wissenschaftler können dieses fortschrittliche Promotersystem nutzen, um besser zu verstehen, wie Zellen auf überschüssige Proteine reagieren, was in Bereichen von der Gentechnik bis zur Medizin entscheidend ist.

Die Fähigkeit, hohe Proteinmengen zu produzieren, könnte zu Innovationen bei der Entwicklung von Medikamententherapien, Impfstoffen und der tieferen Untersuchung von Genfunktionen führen.

Da sich die Forschung zur Genexpression weiterentwickelt, werden Werkzeuge wie der P36-Promotor entscheidend sein, um Entdeckungen zu machen, die erhebliche Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheit haben könnten.