Neue Methode zur Wiederverwertung von Oberflächen in molekularen Studien

Die Messung des Verhaltens einzelner Moleküle auf Oberflächen ist wichtig für viele wissenschaftliche Studien. Damit die Ergebnisse genau sind, müssen die verwendeten Oberflächen sehr gut vorbereitet sein. Das bedeutet, dass sie keine unerwünschten Materialien haften lassen, wenig Hintergrundgeräusche erzeugen und minimal mit den daran angelagerten Molekülen interagieren sollten. Um dies zu erreichen, werden spezielle Methoden zur Oberflächenvorbereitung eingesetzt, bei denen Substanzen wie Rinderserumalbumin (BSA), Polyethylenglykol (PEG) und Kasein verwendet werden.

#Oberflächenvorbereitung

Um Oberflächen zu schaffen, die sich für die Messung einzelner Moleküle eignen, müssen eine Reihe von Schritten befolgt werden. Oft erfordert das, die Oberfläche mit speziellen Materialien zu beschichten, um unerwünschte Interaktionen zu verhindern. Zum Beispiel kann die Verwendung von PEG in verschiedenen Grössen helfen, die Oberflächenqualität zu verbessern. Wenn ein kleinerer PEG auf einen grösseren aufgetragen wird, kann das unerwünschte Bindungen um das Dreifache verringern. In einigen Fällen kann eine Mischung aus Detergenzien die Oberflächenqualität weiter erhöhen, indem sie die Oberfläche hydrophober macht und unerwünschte Bindungen um bis zu zehnmal reduziert. Diese Methode ist jedoch nicht in jeder Situation geeignet, da sie dazu führen kann, dass kurze DNA-Moleküle oder Farbstoffe haften bleiben und sich auf unvorteilhafte Weise bewegen.

Die Reinigung der Objektträger vor dem Aufbringen dieser Beschichtungen ist ebenfalls wichtig, besonders wenn die Objektträger wiederverwendet werden. Für eine effektive Reinigung können die Objektträger mit verschiedenen Lösungen und Methoden behandelt werden, wie zum Beispiel mit Kaliumhydroxid und Aceton eingeweicht und dann mit einer starken Reinigungslösung gewaschen. Dieser Prozess entfernt die alten Beschichtungen und bereitet die Oberfläche für neue Messungen vor.

Nachdem die Oberfläche gereinigt ist, wird sie in kleinere Abschnitte unterteilt, was die Durchführung mehrerer Messungen erleichtert. Puffer müssen durch diese Abschnitte fliessen können, und das Bohren von Löchern, um diesen Fluss zu ermöglichen, kann Zeit und Kosten für den Prozess hinzufügen.

#Bedeutung der Konsistenz in den Messungen

Wenn Wissenschaftler verschiedene Bedingungen testen oder systematische Änderungen in ihren Experimenten vornehmen wollen, sind konsistente Oberflächenbedingungen sehr wichtig. Trotz der harten Arbeit, die in die Vorbereitung der Objektträger gesteckt wurde, kann es immer noch Variationen in der Oberflächenqualität geben. Daher hilft es, denselben Kanal für mehrere Messungen wiederzuverwenden, um die Dinge konsistent zu halten. Das kann bedeuten, mit niedrigeren Konzentrationen der interessierenden Substanzen zu beginnen und diese in den nachfolgenden Messungen schrittweise zu erhöhen.

Wenn jedoch die Oberflächen gewechselt oder neue Moleküle eingeführt werden, muss die Oberfläche zurückgesetzt werden, was bedeutet, dass die Verbindungen, die die Moleküle an ihrem Platz halten, gebrochen werden müssen.

#Häufige Methoden zur Oberflächenanheftung

Eine der häufigsten Methoden zur Anheftung von Molekülen an Oberflächen ist die Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin. Diese Methode beinhaltet das Mischen von biotinmarkierten Substanzen mit nicht markierten und das Hinzufügen von Streptavidin, welches an das Biotin bindet. Durch das Kontrollieren, wie viele biotinmarkierte Moleküle vorhanden sind, können Wissenschaftler die Dichte der Moleküle auf der Oberfläche anpassen. Obwohl diese Bindung sehr stark ist, kann es schwierig sein, die Oberfläche für neue Experimente zurückzusetzen.

Um die Bindungen zu lösen und die Oberflächen wiederzuverwenden, wurden verschiedene Methoden vorgeschlagen. Zum Beispiel kann beim Arbeiten mit DNA und Proteinen die DNA so gestaltet werden, dass sie an einem Ende ein Biotin-Tag hat. Verschiedene Strategien, wie die Einführung von Natriumdodecylsulfat oder eines Puffers mit hohem pH-Wert, können helfen, gebundene Proteine zu entfernen, während die DNA intakt bleibt.

#Einschränkungen der aktuellen Methoden

Obwohl diese Methoden effektiv sind, um die Oberflächen für neue Messungen zu reinigen, gibt es Einschränkungen. Wenn ein Protein-DNA-Komplex im Voraus gebildet werden muss, funktioniert das möglicherweise nicht gut in diesen Situationen. In einigen Fällen müssen Wissenschaftler möglicherweise die DNA und Proteine vollständig von der Oberfläche entfernen, um sich auf neue Studien vorzubereiten. Dies kann den Einsatz sehr starker Lösungen erfordern, die möglicherweise die Oberflächenqualität schädigen.

#Einführung von photocleavable Biotin

In dieser Studie schlagen wir einen alternativen Ansatz mit photocleavable Biotin vor. Durch die Belichtung dieser Biotin-Moleküle mit UV-Licht für etwa fünf Minuten können Wissenschaftler die Verbindungen ohne die Verwendung von aggressiven Chemikalien brechen. Diese Methode wurde umfassend getestet und zeigte vielversprechende Ergebnisse für das Recycling von Oberflächen über mindestens zehn Zyklen, wobei die Oberflächenqualität während des gesamten Prozesses erhalten blieb.

#Effizienz der UV-Methode

Verschiedene UV-Lichtquellen wurden getestet, um die effektivste zu finden, die sich als UV-Lampe mit einer bestimmten Wellenlänge herausstellte. Es wurde festgestellt, dass fünf Minuten Exposition gegenüber dieser Lampe ausreichten, um alle über photocleavable Biotin gebundenen Moleküle zu entfernen. Diese Methode ermöglicht ein schnelles Recycling und die Möglichkeit, neue DNA-Moleküle für frische Messungen einzuführen.

#RPA und G-Quadruplex-Studien

Die Forschung konzentrierte sich auch auf die Wiederherstellung der biologischen Aktivität während dieser Recyclingprozesse. Die Studien befassten sich mit G-Quadruplex-Strukturen und wie sie sich falten oder entfalten können. Die Wiederherstellung und das Falten dieser Strukturen wurden durch Einzelmolekül-Fluoreszenz- und Energietransfermessungen bewertet.

#Fazit

Insgesamt bietet die Verwendung von photocleavable Biotin mit UV-Bestrahlung einen effektiven Weg, um Oberflächen für die Messung einzelner Moleküle zurückzusetzen. Diese Methode vermeidet die Notwendigkeit für aggressive Chemikalien, ist praktisch für die wiederholte Verwendung und zeigt keine Anzeichen für eine Verschlechterung der Oberflächenqualität. Durch den Fokus auf effizientere und zuverlässigere Methoden können Wissenschaftler weiterhin ihre Studien über das molekulare Verhalten auf Oberflächen vorantreiben.