質量分析を用いたアイソフォーム検出の進展

質量分析法（MS）は、生物学でタンパク質を研究するための強力なツールだよ。その重要な応用の一つは、人間の遺伝子から作られるタンパク質の全範囲を理解すること。人間の遺伝子は、選択的スプライシングっていうプロセスのおかげで、多くの異なるタンパク質バージョン、つまりアイソフォームを生み出すことができる。これって、一つの遺伝子がいくつもの異なるタンパク質を作って、発達から病気まで様々な役割を果たすってことなんだ。だから、この複雑さを考えると、これらのタンパク質アイソフォームを見つけて測定するのはすごく重要なんだよ。

多くの遺伝子から考えられるタンパク質を知っているにもかかわらず、実際のタンパク質配列はほとんどがRNAデータに基づく推測なんだ。推測されたタンパク質の多くは、実際のタンパク質テストでは検出されていない。これによって、生きている生物にそれらが存在するのか、どんな役割を持つのか疑問が残るよ。従来のMS手法では、これらのアイソフォームの多くを見逃しちゃうことが多いんだ。なぜなら、それらのペプチド信号が弱くて検出が難しいから。

MSを使ってこれらのアイソフォームを見つけるには、生物学的および技術的な課題がある。通常、選択的アイソフォームは少ない量で見つかるし、特有のペプチド識別子を持っていないことも多い。これが、正確に測定するのを難しくしてるんだ。多くのMS手法では、最も豊富なタンパク質信号しか検出されず、あまり一般的でないアイソフォームを見逃しちゃう。

さらに、タンパク質データベースにまだ記録されていないアイソフォームがたくさんある。多くのタンパク質はまだラベル付けされていないし、異なる病気の状態における一部のタンパク質の実際の配列もわかっていない。この情報の不足は、アイソフォームを見つけて研究するための改良された手法の必要性を浮き彫りにしてるんだ。

#シーケンシング技術の進歩

最近、研究者たちはロングリードRNAシーケンシングの進歩を遂げた。この手法では、フルレングスのRNA配列を正確に読み取れるんだ。この技術を使うことで、科学者たちはサンプルにどのタンパク質アイソフォームが存在する可能性があるかを特定できる。このプロセスは、よりターゲットを絞ったタンパク質検出のための参考を提供する。

これらの配列予測を高度なMS技術と組み合わせることで、特定のペプチドを効果的に識別する新しいアプローチを開発できる。選択反応モニタリング（SRM）や並列反応モニタリング（PRM）などの手法は、感受性と速度を向上させるために強化された。これらの新しいターゲットMS手法では、数百または数千のペプチドを一度に追跡できるんだ。

新しいアプローチの一つであるTomahtoは、動的保持時間調整を使用する。これによって、科学者たちは特定のペプチドが実験中にいつ現れるかを予測して、MS設定をそれに応じて調整できるようになるんだ。別の方法では、特定のペプチドの検出を促進するために安定同位体ラベルペプチドを使う。

これらの進歩は、検出されるペプチドの数を増やし、実験の再現性や感受性を向上させる可能性を示している。最近の研究では、これらのターゲットMS手法を使って既知の病気や細胞の老化、他の生物学的経路を探ることに焦点を当てている。

#アイソフォーム検出の提案された解決策

選択的タンパク質アイソフォームの検出の課題に取り組むために、研究者たちはロングリードシーケンシングデータとターゲットMSを組み合わせることを提案している。アイディアは、特定のタンパク質アイソフォームに関連することが知られているペプチドに焦点を当てること。合成ペプチドトリガーを使うことで、科学者たちはこれらの重要なペプチドの検出を強化できると信じている。

目標は、ターゲットMSを使って既知のタンパク質を測定するだけでなく、まだ文書化されていない新しいタンパク質を発見することだ。MSイベントのために合成トリガーを使用することが、これらの新しいペプチドの存在を確認するのに役立つかもしれない。

この研究では、研究者たちは人間の幹細胞モデルを使ってこの組み合わせアプローチの効果を示すことを目指している。ロングリードシーケンシングを使用してタンパク質アイソフォームを予測し、その後、予測されたアイソフォームに関連する特定のペプチドを検出するためのターゲットMS戦略を展開するつもりだ。

#細胞培養技術

この研究で使用された人間の誘導多能性幹細胞株は、健康な男性から作成されたんだ。これらの幹細胞は、成長をサポートする特定の培地を使って培養された。成長中、細胞は定期的に監視されて、常に多能性状態に保たれていることを確認されたんだ。

分析のために細胞を収穫するとき、細胞は洗浄され、収集され、将来の実験のために低温で保存された。

#ロングリードシーケンシング手法

細胞株中の選択的アイソフォームを特定するために、収穫した細胞から全RNAが抽出された。このRNAは、シーケンシングに適した質であることを確認するために分析された。研究者たちは、ロングリードシーケンシングのためにRNAを準備する特別なキットを使用して、サンプル中に存在するフルレングスRNA転写物について詳細な情報を得ることができた。

シーケンシングの後、ユニークな分析パイプラインを使用してデータを処理した。これには、RNA配列の分類と質の評価、これらの配列がタンパク質をコードする可能性のあるものを予測し、最終的に最も可能性の高いタンパク質アイソフォームを特定することが含まれた。

このプロセスを通じて、彼らは細胞株に存在する遺伝子からかなりの数のタンパク質コーディングアイソフォームを予測できた。

#ターゲットペプチドの選定

研究を続けるために、科学者たちはさらに分析するために特定のペプチドに焦点を当てる必要があった。彼らは計算手法を使用して、予測されたタンパク質配列をシミュレートされた消化プロセスを使ってより小さな部分であるペプチドに分解した。

この研究で選ばれたペプチドは、大きいアイソフォームまたは小さいアイソフォームのどちらかに特有に対応するものだった。最終的には、実験にとって重要な192のペプチドが選ばれた。

これらのペプチドは、ターゲットMSアプローチでのトリガーとして使用するためにラボで合成された。

#アイソフォーム特異的ペプチド分析の実験フロー

合成ペプチドが準備されたら、それらは人間の幹細胞からのタンパク質抽出物と組み合わされた。このサンプルは、その混合物に存在するペプチドを検出するために様々なMS分析にかけられた。

科学者たちは、従来のデータ依存取得（DDA）と新しいTomahtoアプローチなど、異なる分析方法の比較を含む実験をデザインした。この比較によって、ターゲットペプチドを検出する各方法の効果を評価することができる。

#新しい方法のベンチマーク

初期の実験は、Tomahtoメソッドの能力をテストするために既知のタンパク質を使って行われた。既知のタンパク質の明確な混合物が分析され、どれだけこの手法が低濃度のペプチドを検出できるかを調べた。

結果は、TomahtoがDDAよりも多くのペプチドを特定できることを示した。特にとても少ない初期量でもこれが確認された。これは、新しい手法がより感受性があり、タンパク質アイソフォームに関する情報をより多くキャッチできることを示している。

Tomahtoが既知のタンパク質を測定するのに効果的であることが確認された後、研究者たちは幹細胞からのペプチドサンプルを分析する段階に進んだ。

#幹細胞におけるアイソフォーム特異的ペプチドのターゲティング

高度なTomahto手法を使って、科学者たちは人間の幹細胞から得られたペプチド混合物を分析した。目標は、以前のロングリードシーケンシングの努力から予測されたアイソフォームに特有のペプチドを特定することだった。

この分析には、異なる文脈でアイソフォーム特異的な情報を捕える能力を評価するために、無分画と分画されたサンプルの両方が含まれた。実験の結果は、Tomahtoが従来の方法よりもはるかに多くのターゲットペプチドを成功裏に特定できることを示した。

#大きいアイソフォームと小さいアイソフォームの検出に関する発見

ペプチドの成功した特定により、研究者たちはTomahtoが大きいアイソフォームと小さいアイソフォームの両方を明確に検出できることを確認できた。多くの場合、通常は検出が難しい小さいアイソフォームすら、この手法によって捉えられた。

この発見は、組み合わせアプローチの効果を強調している。対応するMS1検出信号なしでペプチドを特定できる能力は、特にこれらの小さいアイソフォームを検出するのに重要だった。

ただ、いくつかのペプチドは存在するにもかかわらず検出されなかった。これは、ペプチドの安定性や追加の修飾が検出に影響を与えるなどの様々な要因に起因しているとされている。

#アイソフォーム発現の視覚化と確認

見つけた成果をさらに検証するために、カスタムのゲノムブラウザトラックが作成された。これにより、科学者たちは特定されたペプチドとそれに対応するRNA転写物との関係を視覚化できた。このインタラクティブなビューは、検出されたタンパク質アイソフォームの発現と役割を理解するための貴重な文脈を提供した。

この視覚化を通じて、科学者たちは特定されたペプチドが遺伝子発現や選択的スプライシングの大きな枠組みにどのようにフィットしているかを見ることができた。

#結論

この研究は、ロングリードシーケンシングデータとターゲットMS技術を組み合わせることで、タンパク質アイソフォームを検出する能力が大幅に向上することを示している。このアプローチは、以前は観察されていなかったアイソフォームを発見することを可能にし、それらの潜在的な機能についての重要な洞察を提供する。

Tomahtoメソッドの利点は、複雑な混合物からペプチドを特定するのにおいて従来のMS手法を上回ることができるということを明らかにしている。この進歩は、様々な生物学的プロセスや病気におけるタンパク質アイソフォームの役割をより深く探るための扉を開く。

今後の研究は、さらなる方法の洗練を目指し、この組み合わせアプローチの潜在能力を広範な状況で探求し、タンパク質の複雑な世界とその健康や病気における役割をより良く理解することに貢献する予定だ。