Fortschritte im Gen-Tagging mit dem qTAG-System

Die Überexpression von Genen hilft Wissenschaftlern, herauszufinden, wie Gene funktionieren und wie sie mit Krankheiten zusammenhängen. Allerdings hat dieses Verfahren auch seine Nachteile. Wenn es zu viel von einem Protein gibt, kann es am falschen Ort in der Zelle landen. Das kann ändern, wie die Proteine miteinander interagieren, was zu unerwarteten Konsequenzen in der Zelle führen kann. Deshalb ist es wichtig, Proteine in ihren natürlichen Mengen zu betrachten. So können Forscher besser untersuchen, wie sich ein Protein verhält, wo es hingeht und wie es mit anderen Proteinen interagiert.

#CRISPR-Technologie und ihre Auswirkungen auf die Genbearbeitung

Seit 2012 hat CRISPR die Welt der Molekularbiologie revolutioniert. Dieses Tool ermöglicht es Wissenschaftlern, DNA auf präzise Weise zu bearbeiten. Es nutzt eine Leit-RNA, um Cas-Endonukleasen wie Cas9 zu spezifischen Stellen im Genom zu führen. Dieses System ist besonders nützlich, um Gene mit Tags zu versehen, ohne die Risiken der Überexpression.

Cas9 ist sehr genau darin, die richtigen DNA-Sequenzen zu finden, die geschnitten werden sollen. Mit Hilfe der Leit-RNA kann Cas9 spezifische Bereiche der DNA identifizieren, um Schnitte zu machen. Die natürlichen Reparaturprozesse der Zelle setzen dann ein, um diese Schnitte zu reparieren. Wenn es keine Vorlage zur Reparatur gibt, verbindet die Zelle oft die gebrochenen Enden in einem Prozess, der als Nicht-homologe Endverbindung bekannt ist. Das kann jedoch zu Fehlern wie kleinen Einfügungen oder Löschungen führen, die das Gen stören.

Es gibt auch andere Methoden zur Reparatur von DNA-Brüchen, die genauere Änderungen ermöglichen: Homologe gerichtete Reparatur und mikrohomologe vermittelte Endverbindung. Die homologe gerichtete Reparatur benötigt eine Vorlage mit passenden Sequenzen für eine genaue Reparatur. Die mikrohomologe vermittelte Endverbindung nutzt kürzere passende Sequenzen zur Reparatur. Obwohl diese Methoden genauer sind als die nicht-homologe Endverbindung, sind sie weniger effizient und können länger dauern, bis sie aktiviert werden.

Wegen dieser Herausforderungen führt das Einfügen grosser genetischer Sequenzen oft zu niedrigen Erfolgsquoten. Forscher haben Schwierigkeiten, Zellen mit den gewünschten Änderungen zu isolieren.

#Verbesserung der Effizienz der DNA-Bearbeitung

Anstatt sich darauf zu konzentrieren, die CRISPR-Technologie selbst zu verbessern, untersuchen Forscher, wie man die Spender-DNA, die bei der Genbearbeitung verwendet wird, besser machen kann. Das bedeutet in der Regel, dass Spenderkonstrukte erstellt werden, die die gewünschten Tags und einen Marker zur einfachen Identifizierung bearbeiteter Zellen enthalten. Verschiedene Strategien wurden vorgeschlagen, um dies zu erreichen, die in zwei Hauptkategorien fallen: promoterbasierte Kasetten und multizistronische Kasetten.

Promoterbasierte Kasetten beinhalten ein Gen-Tag, gefolgt von einem separaten Promoter, der die Expression eines Markers antreibt. In multizistronischen Kasetten helfen andere Elemente, den Marker zusammen mit dem Tag auszudrücken. Leider sind diese bestehenden Methoden oft umständlich und kompliziert, was es vielen Labors schwer macht, sie effektiv zu nutzen.

#Entwicklung des qTAG-Systems

Als Antwort auf diese Herausforderungen wurde eine neue Reihe optimierter Reparaturkasetten namens „quickTAG“ (qTAG) entwickelt. Dieses System zielt darauf ab, den Bearbeitungsprozess und die Auswahl für taggende Zelllinien zu vereinfachen. Das qTAG-System bietet ein einfaches Plasmiddesign, das sich leicht an verschiedene Tags und Marker anpassen lässt.

Das Design dieser Plasmide ermöglicht sowohl fluoreszierendes als auch nicht-fluoreszierendes Tagging, was sie vielseitig für verschiedene Experimente macht. Zusätzlich gibt es Hinweise auf Zeitpläne und Strategien zur Erlangung homozygoter Zelllinien. Durch die Bereitstellung dieser Plasmide auf einer öffentlichen Plattform soll das Tagging von Genen zugänglicher gemacht werden und Forscher ermutigt werden, dieses System für zukünftige Studien zu übernehmen.

#Merkmale des qTAG-Systems

Die qTAG-Kasetten basieren auf einer bekannten Struktur, die mehrere wichtige Eigenschaften zur Verbesserung der Benutzerfreundlichkeit aufweist. Diese Elemente beinhalten:

1. Design-Optionen: Das System bietet Designs zum Hinzufügen von Tags an beiden Enden eines Gens.
2. Einfache Klonierung: Bestimmte Klonierungssequenzen im Design erleichtern die Arbeit mit verschiedenen Tags und Markern.
3. Anpassbarkeit: Einzigartige Restriktionsstellen erlauben unkomplizierte Änderungen an Tags oder Markern.
4. Markerentfernung: Besondere lox-Stellen flankieren das Markergen, was dessen Entfernung nach dem Tagging-Prozess ermöglicht.

#Verwendung des qTAG-Systems in Experimenten

#Bearbeitung fluoreszierender Proteine mit dem qTAG-System

Um zu testen, wie gut das qTAG-System funktioniert, konzentrierten sich die Forscher darauf, ein bestimmtes Histonprotein-H2BC11-mit einem fluoreszierenden Protein namens moxGFP zu taggen. Eine Strategie wurde entwickelt, um den moxGFP-Marker in das Gen für H2BC11 einzufügen, damit die Forscher seinen Standort und sein Verhalten in den Zellen verfolgen können.

Verschiedene Bearbeitungsmethoden wurden angewendet, und beide Techniken führten erfolgreich dazu, dass das Tag in das Histongens eingeführt wurde. Nach der Auswahl gab es einen merklichen Anstieg der Zellen mit dem gewünschten fluoreszierenden Protein, was die Wirksamkeit des Tagging-Prozesses bestätigte.

Zusätzlich wurden diese Tagging-Methoden in verschiedenen menschlichen Zelllinien getestet, was ähnliche Erfolgsquoten nach der Auswahl ergab. Tests mit anderen Auswahlmarkern führten ebenfalls zu positiven Ergebnissen und bestätigten die Flexibilität des qTAG-Systems.

#Serielles Gen-Tagging und Markerentfernung

Der nächste Schritt untersuchte, wie das qTAG-System die Wiederherstellung der Antibiotikaresistenz nach dem Tagging eines Gens ermöglicht. Die Forscher zielten auf zwei Gene ab: TUBB4B und H3C2. Zuerst fügten sie ein fluoreszierendes Tag in TUBB4B ein und verwendeten dann eine Technik, um das wählbare Markergen zu entfernen. Diese Methode erzeugte eine Zelllinie, die für weiteres Tagging verwendet werden konnte, ohne die vorherige Resistenz zu behalten.

#Anwendungen des nicht-fluoreszierenden Taggings

Die Anpassungsfähigkeit des qTAG-Systems geht über fluoreszierendes Tagging hinaus. Forscher zeigten, wie nicht-fluoreszierende Tags verwendet werden können, um Proteininteraktionen und -abbau zu untersuchen. Indem sie diese mit wählbaren Markern kombinierten, konnten sie effizient getaggte Proteine zur Studie isolieren.

Zum Beispiel wurde das Protein der Kernmembran LMNB1 erfolgreich mit verschiedenen nicht-fluoreszierenden Sequenzen getaggt. Dazu gehörten Biotinligasen zur Untersuchung von Proteininteraktionen, gezielte Abbau-Tags zur Analyse des Proteinumsatzes und Epitop-Tags für Situationen, in denen spezifische Antikörper nicht verfügbar waren.

#Erweiterung der Möglichkeiten von qTAG

Eine der Stärken des qTAG-Systems ist sein Potenzial zur Erweiterung. Forscher haben begonnen, neue und hellere Tags zu integrieren, wie das kürzlich entwickelte mStayGold. Dieser Tag ist besonders nützlich für die Bildgebung von Proteinen über längere Zeiträume, da er widerstandsfähiger gegen das Verlust seiner Helligkeit ist.

Durch das einfache Austauschen alter Tags gegen neue können Wissenschaftler eine breitere Palette von Anwendungen erkunden. Zum Beispiel ermöglicht mStayGold Forschern, Proteine auf ihren natürlichen Ebenen zu verfolgen, was zu neuen Erkenntnissen in der Live-Cell-Bildgebung führen könnte.

#Anpassung der qTAG-Struktur für verschiedene Anwendungen

Das qTAG-System ist nicht nur auf sein ursprüngliches Design beschränkt. Forscher werden ermutigt, die Struktur zu modifizieren, um unterschiedlichen experimentellen Bedürfnissen gerecht zu werden. Beispielsweise können sie die 2A-Peptidverbindungen durch einen Promoter ersetzen, um die Auswahl bei der Arbeit mit Genen mit niedriger Expression zu verbessern.

Diese Flexibilität öffnet die Tür für die Schaffung von Kasetten, die komplexere Szenarien angehen können, wie das Generieren von Knockouts von Zielgenen oder die Sicherstellung, dass die Integration an bestimmten Stellen im Genom erfolgt.

#Wählbare Knockouts

Durch die Anpassung des qTAG-Systems zur Berücksichtigung wählbarer Knockouts können Forscher schnell Genstörungen erzeugen. Diese neue Methode vereinfacht den Prozess und macht ihn schneller und effizienter als traditionelle Ansätze.

#Safe Harbour Integration

Eine weitere innovative Anwendung des qTAG-Systems besteht darin, in "Safe Harbour"-Standorte im Genom zu integrieren. Safe Harbour-Stellen bieten stabile Orte, an denen neues genetisches Material mit minimaler Störung der Wirtszelle eingesetzt werden kann. Das stellt sicher, dass die neuen Elemente ordnungsgemäss funktionieren, ohne essentielle Zellfunktionen zu beeinträchtigen.

#Fazit

Durch die Entwicklung und Anwendung des qTAG-Systems haben Forscher eine vielseitige Plattform zur Untersuchung der Genfunktion geschaffen. Dieses System bietet zugängliche Werkzeuge, die es einfacher machen, Gene zu taggen und ihr Verhalten in lebenden Zellen zu studieren. Durch die Möglichkeit einfacher Modifikationen und Anpassungen hat das qTAG-System vielversprechendes Potenzial für eine breite Palette zukünftiger Anwendungen in der Molekularbiologie.