Verstehen, wie HIV auf infizierte Zellen wirkt

Wir wissen nicht genau, warum manche Menschen mit HIV unterschiedliche Mengen des Virus in ihrem Blut haben. Wir haben untersucht, ob eine hohe Virusmenge im Blut mit vielen infizierten Zellen verbunden ist, die Anzeichen des Virus zeigen. Wir haben herausgefunden, dass die Virusmenge im Blut nicht mit der Anzahl der infizierten Zellen, die das Virus zeigen, verknüpft war; stattdessen hing es einfach mit der Gesamtzahl der infizierten Zellen zusammen. Diese Ergebnisse helfen zu klären, wie HIV den Körper beeinflusst und deuten darauf hin, dass die Kontrolle passiert, nachdem das Virus anfängt, seine Kopien zu machen.

#Einführung

HIV infiziert hauptsächlich eine Art von Immunzellen, die CD4+ T-Zellen genannt werden. Das Virus heftet sich an einen Rezeptor auf diesen Zellen und dringt ein. Sobald es drinnen ist, gibt es seinen Kern frei, der dann zum Zellkern der Wirtszelle wandert, wo er sich selbst kopiert. Danach wird die genetische Information des Virus in die DNA des Wirts eingefügt, um ein Provirus zu erstellen. Die Zelle nutzt dann ihre eigene Maschinerie, um Kopien des genetischen Materials des Virus zu erstellen, die in zwei Formen vorliegen: gespleisste und ungespleisste RNA. Die ungespleisste RNA wird in neue Viruspartikel verpackt, die dann andere Zellen infizieren können. Der konstante Virusgehalt im Blut hängt davon ab, wie viele Zellen infiziert sind und wie viele Viruspartikel in jedem Infektionszyklus produziert werden. Dieser Wert ist ein wichtiger Indikator dafür, wie die Krankheit zu AIDS fortschreitet und zum Tod führen kann.

Bei Menschen mit unbehandeltem HIV kann die Virusmenge im Blut stark variieren, von sehr niedrig bis extrem hoch. Studien zeigen, dass diejenigen mit niedrigen Viruswerten (genannt viremic controllers) normalerweise viel weniger infizierte Zellen haben im Vergleich zu denen mit hohen Viruswerten (non-controllers). Das bringt uns dazu zu fragen, ob viremic controllers auch weniger Zellen haben, die Anzeichen des Virus zeigen. Wir wollten herausfinden, wie die Virusmenge im Blut mit der Anzahl der infizierten Zellen, die ungespleisste RNA zeigen, zusammenhängt.

#Teilnehmer und Mustermerkmale

Um den Zusammenhang zwischen Viruslevels und infizierten Zellen mit ungespleisster RNA zu untersuchen, haben wir Blutproben von acht unbehandelten Spendern mit niedrigen Viruslevels und sieben mit hohen Viruslevels untersucht. Die Blutproben wurden direkt entnommen, um zu vermeiden, dass während der Verarbeitung Zellen verloren gehen. Die meisten infizierten Zellen im Blut sind CD4+ T-Zellen, also kam die ungespleisste RNA, die wir nachgewiesen haben, hauptsächlich aus diesen Zellen.

Die Gruppe mit niedriger Viremie hatte eine niedrige, aber nachweisbare Virusmenge, während die Gruppe mit hoher Viremie eine sehr hohe Virusmenge hatte. Die Teilnehmer waren hauptsächlich männlich, und ihre ethnischen Zugehörigkeiten umfassten schwarz, weiss und multikulturell. Sie lebten im Durchschnitt seit etwa neun Jahren mit HIV. Einige hatten frische Infektionen, während andere Behandlungspausen hatten.

#Virologische Charakterisierung von viremic controllers und non-controllers

Bevor wir die Anzahl der infizierten Zellen verglichen, haben wir zuerst die Viruslevels in beiden Gruppen gemessen und die Anzahl der infizierten Zellen geschätzt, indem wir nach HIV-DNA im Blut gesucht haben. Wir fanden heraus, dass die Plasma-Viruslevels in der Gruppe mit niedriger Viremie signifikant niedriger waren als in der Gruppe mit hoher Viremie. Ebenso war die Anzahl der infizierten Zellen auch viel niedriger in der Gruppe mit niedrigem Virus. Es gab keinen Zusammenhang zwischen der Anzahl der infizierten Zellen und wie lange die Teilnehmer infiziert waren. Wir bemerkten jedoch einige Trends bezüglich der Gesundheit ihrer Immunzellen.

Wir entdeckten einen starken Zusammenhang zwischen der Menge des Virus im Blut und der Anzahl der infizierten Zellen, aber diese Entdeckung erklärt nicht, wie aktiv diese infizierten Zellen bei der Produktion neuer Viruspartikel sind.

#Die Gesamtzahl der infizierten Zellen mit ungespleisster RNA

Wir untersuchten, ob die Gesamtzahl der Blut Zellen mit ungespleisster RNA mit den Viruslevels korrelierte, indem wir eine spezifische Methode verwendeten, die dazu entworfen wurde, individuelle infizierte Zellen zu analysieren. Dieser Ansatz erlaubte es uns, die Gesamtmenge an ungespleisster RNA im Blut jedes Teilnehmers zu beurteilen.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Gesamtzahl der infizierten Zellen mit ungespleisster RNA signifikant niedriger in der Gruppe mit niedrigem Virus war als in der Gruppe mit hohem Virus. Wir fanden auch eine starke positive Beziehung zwischen den Viruslevels im Blut und der Anzahl der Zellen mit ungespleisster RNA. Ausserdem gab es eine direkte Korrelation zwischen der Gesamtzahl der infizierten Zellen und denen, die ungespleisste RNA enthielten.

Wir schauten genauer hin, wie oft Zellen mit hohen Mengen an ungespleisster RNA vorkamen. Wir definierten diese Zellen als solche, die mehr als zehn ungespleisste RNA-Kopien hatten. Wieder fanden wir signifikant weniger dieser "hoch-exprimierenden" Zellen in der Gruppe mit niedrigem Virus. Wir beobachteten eine klare Verbindung zwischen der Anzahl der hoch-exprimierenden Zellen und den Viruslevels im Blut.

#Der Anteil der infizierten Zellen mit ungespleisster RNA

Als Nächstes wollten wir den Anteil der infizierten Blut Zellen messen, die ungespleisste RNA in beiden Gruppen hatten. Wenn die Gruppe mit niedrigem Virus eine bessere Blockade der Virusaktivität hätte, würden wir erwarten, dass sie einen kleineren Anteil infizierter Zellen mit ungespleisster RNA im Vergleich zur Gruppe mit hohem Virus zeigen. Unsere Analyse zeigte, dass nur ein kleiner Anteil infizierter Zellen ungespleisste RNA in beiden Gruppen enthielt, und dieser Anteil war nicht signifikant unterschiedlich.

Wichtig ist, dass diese Ergebnisse darauf hindeuten, dass die Viruslevels im Blut nicht mit dem Prozentsatz der infizierten Blut Zellen, die ungespleisste RNA exprimieren, zusammenhängen. Es deutet auch darauf hin, dass die meisten infizierten Zellen zu dem Zeitpunkt, als wir die Proben entnahmen, kein Virus produzierten.

#Die Mengen an ungespleisster RNA in einzelnen infizierten Zellen

Wir analysierten auch die Menge an ungespleisster RNA in einzelnen infizierten Zellen. Wir stellten fest, dass die durchschnittliche Anzahl ungespleisster RNA-Kopien pro infizierter Zelle zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschiedlich war. Auch wenn wir keine grossen Unterschiede zwischen der niedrigen und der hohen Virusgruppe in Bezug auf die ungespleissten RNA-Werte in den meisten Zellen sahen, bemerkten wir einen leichten Trend, dass "hoch-exprimierende" Zellen in der Gruppe mit niedrigem Virus weniger Kopien ungespleisster RNA hatten im Vergleich zur Gruppe mit hohem Virus.

#Phylogenetische Analyse der HIV-unspliced RNA

Um die genetische Vielfalt der HIV-unspliced RNA in beiden Gruppen zu sehen, sequenzierten und analysierten wir das Virus, das im Blut und in den infizierten Zellen gefunden wurde. Wir wollten herausfinden, ob die Virusvielfalt zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich war. Unsere Erkenntnisse zeigten, dass die genetische Vielfalt von HIV zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschiedlich war. Wir bemerkten, dass sowohl die Gruppe mit niedrigem als auch mit hohem Virus diverse Populationen von Proviren hatten, die aktiv ungespleisste RNA produzierten.

#Fazit

Unsere Forschung konzentrierte sich darauf, ob es einen Unterschied in der Aktivität von Proviren zwischen Individuen mit niedrigen und hohen Viruslevels gibt. Wir fanden heraus, dass weniger als zehn Prozent der Proviren in beiden Gruppen ungespleisste RNA exprimieren, unabhängig von den Viruslevels im Blut. Die Kontrolle des Virus bei Individuen mit niedrigeren Levels scheint mehr aus der geringeren Anzahl infizierter Zellen zu resultieren, als aus einem Unterschied in der Aktivität der Proviren.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mechanismen zur Kontrolle von HIV sich von denen bei Elite-Controllern unterscheiden können, bei denen eine verbesserte Blockade der proviralen Expression vorgeschlagen wurde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der Fokus auf die Verbesserung der Kontrolle von HIV darauf liegen sollte, infizierte Zellen zu eliminieren, obwohl die Verbesserung der Unterdrückung der proviralen Expression auch helfen könnte, eine langfristige Remission zu erreichen.

#Materialien und Methoden

#Teilnehmerkohorte und Probenentnahme

Blutproben wurden von Personen mit HIV entnommen, die keine ART erhielten. Die Teilnehmer wurden im Rahmen von Studien eingeschrieben, die von den zuständigen Ethikkommissionen genehmigt wurden. Alle Spender gaben schriftliche Einwilligung für die Forschung. Wir sammelten Blut zu einem Zeitpunkt, als das Virus sich auf einem stabilen Niveau eingestellt hatte.

#HIV-DNA-Spiegel

Um die Anzahl der infizierten Zellen zu schätzen, massen wir die HIV-DNA-Spiegel im Blut. Wir verwendeten einen spezialisierten Test, um die Anzahl der infizierten Zellen genau zu bewerten.

#Übersicht über die Zell-assoziierte RNA- und DNA-Einzelgenom-Sequenzierung (CARD-SGS)

Die CARD-SGS-Methode wurde angepasst, um die Fähigkeit zur Erkennung von HIV-RNA aus kleinen Mengen infizierter Zellen zu verbessern. Diese Methode umfasst die Extraktion von Gesamtnukleinsäure und deren Vorbereitung für eine detaillierte Analyse, die es uns ermöglicht, die HIV-RNA in einzelnen Zellen zu untersuchen, während sichergestellt wird, dass die Extraktion anderer Komponenten unsere Ergebnisse nicht beeinträchtigt.

#Detaillierte CARD-SGS-Methode

Wir folgten einer Reihe von Schritten, um Proben vorzubereiten und RNA zu extrahieren, die bis zur Einzelgenom-Verstärkung der HIV-RNA-Moleküle führten. Jeder Schritt wurde entworfen, um eine hohe Sensitivität und Genauigkeit bei der Messung der Aktivität von HIV in den einzelnen infizierten Zellen zu gewährleisten.

#Verfügbarkeit von Sequenzdaten

Alle während dieser Studie gesammelten Daten sind zur Überprüfung verfügbar.

#Statistische Analysen

Wir führten mehrere statistische Analysen durch, um die Beziehungen zwischen verschiedenen Variablen in unserer Studie zu verstehen. Jede Methode wurde entsprechend der Natur der Daten und der Beziehungen, die wir analysieren wollten, ausgewählt.