Neue RNA-gebundene Methode beleuchtet die Genregulation

RNA, oder Ribonukleinsäure, spielt eine wichtige Rolle in unseren Zellen. Es trägt genetische Informationen, hilft beim Aufbau von Proteinen und reguliert, wie Gene ausgedrückt werden. RNA durchläuft viele Schritte in ihrem Leben innerhalb einer Zelle, einschliesslich Spleissen, Bearbeiten, Lokalisierung, Translation und Abbau. Diese Schritte werden von Komplexen aus RNA-bindenden Proteinen (RBPs), Adapterproteinen und regulatorischen Faktoren durchgeführt.

Es gibt über 2.000 menschliche Gene, die Proteine erzeugen, die an diesen Komplexen beteiligt sind. Einzelne RNA-assoziierte Proteine können den Stoffwechsel von unzähligen RNA-Molekülen beeinflussen. Mutationen in diesen Proteinen sind mit verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen verbunden. Daher ist es wichtig, zu untersuchen, wie RBPs und verwandte Faktoren den RNA-Stoffwechsel beeinflussen, um die Genregulation und die zugrunde liegenden Mechanismen menschlicher Krankheiten zu verstehen.

#Einschränkungen im Verständnis des RNA-Stoffwechsels

Trotz vieler Forschungen zum RNA-Stoffwechsel und der Funktion von RBPs verstehen wir immer noch nicht alle zellulären Faktoren, die spezifische RNA-Prozesse regulieren. Dieses unzureichende Verständnis entsteht, weil RBPs den Stoffwechsel ihrer Ziel-RNAs je nach Faktoren wie Bindungsstärke und Standort entweder verändern oder keinen Einfluss darauf haben können. Viele RBPs können auch mit verschiedenen Ribonukleoprotein-Komplexen interagieren und an verschiedenen RNA-stoffwechselbezogenen Aktivitäten teilnehmen. Zusätzlich können einige Protein-Faktoren, die nicht direkt an RNA binden, dennoch den RNA-Stoffwechsel beeinflussen, indem sie beeinflussen, wie RNAs und RBPs interagieren oder die Mengen und Aktivitäten von RBPs in der Zelle verändern.

Aktuelle biochemische Studien zu RBP-RNA-Interaktionen bieten kein vollständiges Bild aller funktionalen Regulatoren von RNA-Stoffwechselereignissen in Zellen.

#Die Suche nach RNA-Regulationsfaktoren

Genetisches Screening kann helfen, zelluläre Faktoren zu identifizieren, die den RNA-Stoffwechsel regulieren, aber diese Methoden haben ihre Einschränkungen. Zum Beispiel können CRISPR-Screenings, die indirekte Effekte wie Zellwachstum untersuchen, schwer zu entwerfen und zu interpretieren sein aufgrund potenzieller Fehler und kompensatorischer genetischer Mechanismen. Die Verwendung von CRISPR gefolgt von RNA-Sequenzierung kann Einblicke in RNA-Eigenschaften bieten, aber diese Sequenzierungsansätze haben Einschränkungen in der Flexibilität, sind voreingenommen gegenüber häufigeren RNAs und können teuer und arbeitsintensiv sein.

Bisher war es nicht möglich, RNA-spezifische Funktionen menschlicher Proteine im grossen Massstab zu untersuchen und dabei verschiedene RNA-Stoffwechselprozesse direkt zu überwachen.

#Einführung des RNA-gebundenen CRISPR-Screenings

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, haben Forscher einen neuen Ansatz entwickelt. Durch die Kombination von CRISPR-basierten Methoden mit barcodierter RNA zielt diese Methode darauf ab, eine allgemeinere Möglichkeit zu bieten, die Kontrolle verschiedener Ereignisse im RNA-Stoffwechsel zu studieren.

Frühere Studien haben ähnliche Barcodierungstechniken erfolgreich in menschlichen Zellen und Hefen verwendet, um Genmodifikationen mit transkriptionalen Ergebnissen zu verknüpfen. Allerdings hatten traditionelle Methoden Probleme mit der Datenakkuratheit aufgrund der zufälligen Integration genetischen Materials. Um diese Herausforderungen zu umgehen, haben die Forscher eine Methode etabliert, die eine präzise Integration von Komponenten an einem definierten Genomstandort in menschlichen Zellen ermöglicht.

#Design und Validierung einer innovativen RNA-gebundenen Methode

Die Forschung beinhaltete die Schaffung einer Zelllinie mit einem spezifischen Standort für die genetische Integration. Das Team stellte diese Zelllinie her, indem es eine Technik verwendete, die es ihnen ermöglichte, ein induzierbares CRISPR-System und einen zusätzlichen Standort für weitere genetische Manipulationen einzufügen. Dadurch wurde eine stabile und einheitliche Expression der integrierten Gene sichergestellt.

Nachdem das System etabliert war, testeten sie dessen Effektivität mit einem fluoreszierenden Reporter. Sie bestätigten, dass es nach der Modifikation konstant exprimiert wurde und sie das System nach Bedarf ein- und ausschalten konnten.

#Testen neuer Techniken an menschlichen Genen

Um Regulatoren des RNA-Stoffwechsels zu entdecken, konzentrierten sich die Forscher auf Zielgene, die mit RNAs oder RBPs assoziiert sind, und wählten eine Reihe von Leit-RNAs aus, um die Effizienz der Gen-Knockouts zu maximieren. Sie organisierten diese Leit-RNAs zusammen mit zufällig generierten Barcodes in einer genetischen Bibliothek. Die endgültige Bibliothek zielte auf über 2.000 Gene ab, mit mehreren Leit-RNAs für jedes Gen, um eine ausreichende Abdeckung sicherzustellen.

Bei der Bereitstellung dieser Bibliothek in ihre ingenieurtechnisch veränderte Zelllinie zählten die Forscher die Barcodes, die mit jeder Leit-RNA in sowohl genomischer DNA als auch mRNA assoziiert waren. Dieses Zählen ermöglichte es ihnen, zu verfolgen, wie Genveränderungen RNA-Spiegel beeinflussten.

#Beobachtung der Effekte von Gen-Knockouts

Als sie die Effekte der Gen-Knockouts überwachten, zeigten die ersten Tage nach der Modifikation stabile Barcode-Zahlen. Allerdings wurden in späteren Tagen signifikante Veränderungen festgestellt, die klare Auswirkungen auf RNA-Spiegel und Zellfitness anzeigten. Insbesondere Gene, die für das Überleben essentiell sind, wiesen eine deutliche Abnahme sowohl in genomischen als auch in mRNA-Spiegeln auf, was auf eine starke Korrelation zwischen Knockout-Effizienz und Zellgesundheit hinweist.

Die Daten zeigten, dass die RNA-gebundene Strategie den Einfluss genetischer Modifikationen genau erfasste, indem sie nur die zugehörigen Barcodes analysierte.

#Untersuchung der Regulation der mRNA-Translation

Die Forschung wandte die neue Methode zunächst an, um die mRNA-Translation zu untersuchen, einen Prozess, der nicht leicht durch bestehende Screening-Techniken untersucht werden kann. Traditionelle Methoden beinhalten die Trennung von MRNAs basierend auf ihrer Interaktion mit Ribosomen. Durch die Kombination dieser klassischen Techniken mit der neuen RNA-gebundenen CRISPR-Methode wollten die Forscher Faktoren identifizieren, die die mRNA-Translation beeinflussen.

Sie verwendeten eine gut untersuchte mRNA, um ihren Ansatz zu validieren und sicherzustellen, dass ihre Messungen präzise waren. Anschliessend passten sie ihr System an, um verschiedene Faktoren zu analysieren, die die Ribosomenbelegung von mRNA beeinflussen.

#Charakterisierung der Auswirkungen von Genveränderungen

Während sie die Ergebnisse analysierten, dokumentierten die Forscher zahlreiche Gen-Knockouts, die zu einer verringerten Ribosomenbelegung führten. Die Gesamtdaten deuteten darauf hin, dass viele Gen-Knockouts, insbesondere solche, die ribosomale Proteine und Faktoren der Initiation der Translation betreffen, konstant die Übersetzungseffizienz von mRNAs verringerten. Dieser Trend hob die Bedeutung dieser Faktoren bei der Regulierung der mRNA-Übersetzungseffizienz hervor.

#Identifizierung wichtiger Gene in der mRNA-Translation

Unter den Ergebnissen erwiesen sich Gene, die mit der ribosomalen Funktion und der Initiation der Translation verbunden sind, als entscheidende Akteure. Es wurde klar, dass die Aktivität dieser Gene direkt damit verbunden war, wie gut mRNAs mit Ribosomen interagieren. Das Fehlen spezifischer Gene führte zu einer insgesamt geringeren Übersetzungseffizienz, was ihre Rolle in diesem wichtigen zellulären Prozess betonte.

Bestimmte Faktoren der Initiation der Translation wurden ebenfalls identifiziert, die zu Veränderungen in der mRNA-Translation beitragen, allerdings mit mehr Variabilität, was auf ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Proteine in der Translationsmaschinerie hinweist.

#Untersuchung alternativen Spleissens

Die Forscher erweiterten dann ihren Fokus auf alternatives Spleissen, einen Prozess, der verändert, wie mRNAs verarbeitet werden. Traditionelle Ansätze zur Untersuchung des Spleissens sind kompliziert und können unzuverlässige Ergebnisse liefern. Durch die Nutzung der Vorteile der RNA-gebundenen CRISPR-Methode wollte das Team Faktoren identifizieren, die verschiedene Spleissausgänge beeinflussen, indem sie massen, wie Störungen die Verhältnisse verschiedener Spleissvarianten beeinflussten.

Sie entwarfen spezifische Experimente, um verschiedene Formen des Spleissens zu bewerten, was es ihnen ermöglichte, Veränderungen über verschiedene Gen-Knockouts hinweg effektiv zu verfolgen.

#Beobachtung unterschiedlicher Spleissergebnisse

Als das Team die Daten analysierte, fand es sowohl gemeinsame als auch einzigartige Geneffekte über verschiedene Spleissbedingungen hinweg. Einige Gene, die mit den grundlegenden Spleissprozessen assoziiert sind, und andere, die mit Translation und RNA-Stoffwechsel verbunden sind, erwiesen sich als signifikant für die Beeinflussung von Spleissphänotypen.

Die Ergebnisse deuteten auf klare Beziehungen zwischen Spleissen und anderen zellulären Mechanismen hin und beleuchteten, wie verschiedene Proteine zusammen oder unabhängig arbeiten können, um die mRNA-Verarbeitung zu beeinflussen.

#Verständnis der mRNA-Qualitätskontrolle

Die Forscher untersuchten auch die Beziehung zwischen RNA-Stoffwechsel und mRNA-Qualitätskontrollwegen, insbesondere mit dem Fokus auf einen Prozess, der als nonsense-vermittelter Abbau (NMD) bekannt ist. Sie passten ihre Strategie an, um zu untersuchen, wie bestimmte Störungen die Stabilität von mRNAs beeinflussten, die vorzeitige Stoppcodons aufweisen.

Diese Analyse offenbarte zahlreiche Geneffekte, die die Abbauraten dieser fehlerhaften mRNAs beeinflussten, und hob entscheidende Faktoren hervor, die an der Aufrechterhaltung der RNA-Qualität beteiligt sind.

#Einsichten in chemische und genetische Modifikatoren

Neben der Identifizierung wichtiger Gene verwendeten die Forscher chemische Störungen, um regulatorische Wege zu untersuchen, die den RNA-Stoffwechsel beeinflussen. Durch die Behandlung ihrer Zellmodelle mit bestimmten Verbindungen konnten sie feststellen, wie diese Behandlungen mit den physiologischen Auswirkungen verschiedener Gen-Knockouts interagierten.

Ähnlich entwarfen sie genetische Modifikator-Screenings, um ihr Verständnis verschiedener Wege zu erweitern, und bestätigten, dass einige Gene über etablierte Signalisierungsnetzwerke arbeiteten, um den mRNA-Abbau zu regulieren.

#Untersuchung der Reaktionen auf Arzneimittelbehandlungen

Zuletzt erkundete das Team, wie Zellen auf das Chemotherapeutikum Homoharringtonin reagieren, das dafür bekannt ist, die Proteinsynthese zu hemmen. Sie nutzten ihre RNA-gebundene CRISPR-Screening-Methode, um die zellulären Reaktionen auf dieses Medikament zu untersuchen und identifizierten Gene, die entscheidend dafür sind, die mRNA-Spiegel während translationalem Stress aufrechtzuerhalten.

Durch diese Untersuchung entdeckten sie spezifische Faktoren, die den Zellen helfen, mit den Auswirkungen der Arzneimittelbehandlung umzugehen, und offenbarte potenzielle therapeutische Ziele zur Verbesserung von Krebsbehandlungen.

#Fazit

Zusammenfassend stellt die Einführung dieser RNA-gebundenen CRISPR-Screening-Methode einen bedeutenden Fortschritt im Verständnis des RNA-Stoffwechsels, der Translation, des Spleissens und der Qualitätskontrolle dar. Die Entdeckungen, die mit dieser innovativen Technik gemacht wurden, verdeutlichen die komplexen Netzwerke und Interaktionen innerhalb von Zellen, die RNA-Prozesse steuern.

Durch die Analyse tausender Genveränderungen können Forscher die komplexen Beziehungen zwischen RNA-Stoffwechsel und zellulären Funktionen begreifen. Während sich diese Methodologie weiterentwickelt, birgt sie das Potenzial für tiefere Einblicke in die RNA-Biologie und deren Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit.

Dieser neue Ansatz hebt nicht nur die wesentlichen Rollen spezifischer Proteine bei der Regulierung von RNA hervor, sondern legt auch den Grundstein für zukünftige Studien, die sich mit RNA-Prozessen in verschiedenen biologischen und krankheitsbezogenen Kontexten befassen. Die potenziellen Anwendungen dieser Methode zur Untersuchung verschiedener menschlicher Krankheiten, einschliesslich Krebs und Stoffwechselstörungen, sind vielfältig und bieten spannende Möglichkeiten für zukünftige Erkundungen.