Neue Methode zur Erweiterung von Genarrays

Gen-Duplikationen sind ein wichtiger Prozess, wie sich Arten anpassen und entwickeln. Das passiert, wenn ein Gen eine zusätzliche Kopie von sich selbst macht. Es gibt zwei Hauptwege, wie Gene dupliziert werden: Retrotransposition und nicht-allelische homologe Rekombination. Bei der nicht-allelischen homologen Rekombination entstehen ein Paar duplizierter Gene, die nebeneinander liegen. Manchmal kann das zu weiteren Veränderungen führen, was zu mehreren Kopien des Gens führt. Diese Änderung in der Anzahl der Genkopien wird als Kopienanzahlvariation (CNV) bezeichnet.

Ein Weg, wie zusätzliche Kopien eines Gens vorteilhaft sein können, sind Dosierungseffekte. Das bedeutet basically, dass mehr Kopien eines Gens einem Organismus helfen können, sich an Veränderungen in seiner Umgebung anzupassen. Zum Beispiel haben Haushunde mehr Kopien eines Gens namens AMY2B, das ihnen hilft, Stärke zu verarbeiten, im Vergleich zu Wölfen. Diese Unterschiede kommen wahrscheinlich daher, dass Hunde sich an eine Ernährung angepasst haben, die reich an Kohlenhydraten ist, die von Menschen bereitgestellt werden, während Wölfe die ursprüngliche Anzahl an Kopien behalten haben, weil sie in der Wildnis kein hohes Niveau dieses Gens brauchen.

Ein weiteres Beispiel sieht man bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die Variationen in der Anzahl der Kopien des CUP1-Gens aufweist, das für Kupferresistenz verantwortlich ist. Verschiedene Stämme dieser Hefe haben unterschiedliche Anzahl an Wiederholungseinheiten des CUP1-Gens, was zu unterschiedlichen Resistenzen gegen Kupfer führt. Interessanterweise sind die Wiederholungseinheiten in diesen Stämmen nicht identisch, was darauf hindeutet, dass die initialen Duplikationen unabhängig bei ihren Vorfahren aufgetreten sind. Diese Situation zeigt einen Fall von konvergenter Evolution. Während der Domestikation ist CUP1 normalerweise als Einzelkopie in vielen Wildtypen von S. cerevisiae vorhanden, während es in domestizierten Stämmen, die höheren Kupferkonzentrationen ausgesetzt sind, dupliziert werden kann.

Das Erweitern dieser tandemartigen Genarays kann zu einer schnellen Anpassung führen. Zum Beispiel können Forscher im Labor Hefeklone mit erweiterten CUP1-Arrays erzeugen, indem sie sie in hohen Kupferkonzentrationen züchten.

#Langfristige Effekte der Gen-Duplikation

Neben den unmittelbaren Vorteilen können erweiterte Genarrays langfristige Auswirkungen haben. Der Prozess kann zu Änderungen in den Sequenzen führen, die neue Gene erzeugen, bekannt als Paraloge. Dies ermöglicht es einer Genfamilie, zu wachsen. Ein bekanntes Beispiel ist das menschliche β-Globin-Locus, das aus fünf Genen und einem Pseudogen besteht. Diese Anordnung erlaubt die Produktion verschiedener Formen von Hämoglobin in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angepasst an unterschiedliche Sauerstoffniveaus.

Viele Organismen haben grosse Genefamilien, die tandem dupliziert sind. Zum Beispiel haben Menschen und Elefanten Hunderte von olfaktorischen Rezeptor-Genen. Im Gegensatz dazu profitiert das Immunsystem von Pseudogenen, die zur genetischen Diversität beitragen oder nicht-kodierende RNAs produzieren, die biologische Funktionen ausführen. Daher ist die Erhöhung der Genkopien und die Diversifizierung ihrer Sequenzen eine Schlüsselstrategie in der Evolution.

#Genom-Editing und Erweiterung von Genarrays

Aktuelle Fortschritte im Genom-Editing ermöglichen es Wissenschaftlern, diese tandemartigen Genarrays zu manipulieren. Aktuelle Methoden können eine Reduzierung dieser Arrays induzieren, aber es gibt kein etabliertes Verfahren, um sie zu erweitern. Wenn eine Methode entwickelt werden kann, um diese Genkopien effektiv zu erhöhen, könnte das zu einer höheren Produktion wertvoller Genprodukte führen.

Einige Forscher haben festgestellt, dass die Verwendung einer modifizierten Version eines Proteins namens Cas9 sowohl zu einer Kontraktion als auch zu leichten Erweiterungen von Genarrays führen kann. Indem sie verstehen, wie diese Modifikation funktioniert, können Wissenschaftler einen Mechanismus namens Break-induzierte Replikation (BIR) umfunktionieren, um diese Genarrays zu erweitern.

Wenn eine Replikationsgabel bricht, erzeugt sie eine spezielle Art von DNA-Bruch, die als Einzelend-Doppelstrangbruch (seDSB) bekannt ist. Der folgende Prozess kann eine 3′-vorstehenden Einzelstrang-DNA (ssDNA) beinhalten, die sich mit dem Schwesterchromatid integrieren könnte und zu Veränderungen in den Genkopien führt.

Wenn die Replikationsgabel zusammenbricht, kurz bevor sie mit der Replikation des Genarrays fertig ist, besteht die Möglichkeit, dass die ssDNA mit einer Wiederholungseinheit auf demselben Chromosom interagiert, was eine Kontraktion verhindert und möglicherweise zu einer Erweiterung des Arrays führt.

#Implementierung von BITREx

Forscher haben eine Technik namens BIR-vermittelte tandem-Wiederholungserweiterung (BITREx) entwickelt, um die Machbarkeit der Erweiterung von Genarrays zu testen. Sie verwendeten Hefe als Modellsystem, um zu sehen, ob sie die Anzahl der Kopien des CUP1-Gens anhand der Erkenntnisse aus vorherigen Experimenten mit Cas9 erhöhen konnten.

Die BITREx-Methode wurde getestet, indem Stämme von Hefe erzeugt wurden, die das modifizierte Cas9-Protein exprimierten, und dabei Zielregionen in der Nähe des CUP1-Arrays anvisierten. Die Forscher fanden heraus, dass in bestimmten Stämmen nach der Induktion von BITREx eine beträchtliche Zunahme der Anzahl der CUP1-Genkopien zu verzeichnen war.

Obwohl einige Stämme keine Veränderungen zeigten, wiesen die gezielten Stämme eine signifikante Zunahme der Genkopien auf. Die Forscher überwachten die Leistung verschiedener gRNAs, die für spezifische DNA-Sequenzen entworfen wurden. Sie fanden heraus, dass bestimmte gRNAs besonders erfolgreich bei der gewünschten Erhöhung der Genkopien waren.

#Langfristige BITREx-Anwendungen

Die Forscher verfolgten dann eine langfristige Anwendung von BITREx, die die Grösse des Genarrays kontinuierlich erhöhen könnte. Sie führten über 31 Tage Experimente durch, um zu sehen, wie stark die Anzahl der CUP1-Kopien durch wiederholte Runden von BITREx amplifiziert werden konnte.

Ausgehend von einem Stamm mit 14 Kopien des CUP1-Gens gelang es ihnen, die Anzahl der Kopien in einigen Fällen auf über 250 zu erhöhen. In einem Stamm erreichten sie nach weiteren Runden von BITREx eine geschätzte Kopienanzahl von etwa 377.

Diese langfristigen Experimente gaben Einblicke in die Stabilität erweiterter Genarrays. Während es einen signifikanten Anstieg in der Anzahl der Kopien gab, zeigten einige Stämme ein Plateau im Wachstum, was Fragen zu den Grenzen der BITREx-Methode und zur Erhaltung der Genarrays aufwarf.

#Epigenetische Modulation von BITREx

Die Forscher betrachteten auch die Rolle spezifischer Proteine, die den Erfolg von BITREx beeinflussen könnten. Ein solches Protein ist Rtt109, das die Acetylierung von Histonen beeinflusst. Das Vorhandensein von Histonmodifikationen kann entweder die Genexpansion fördern oder unterdrücken.

Durch die Verwendung einer Verbindung, die die Histonacetylierung beeinflusst, entdeckten die Forscher, dass sie BITREx hemmte. Dies führte auch zu einer Reduktion der Anzahl der Kopien des Genarrays und verdeutlichte, wie epigenetische Faktoren die Prozesse der Gen-Duplikation beeinflussen können.

Sie bestätigten, dass das Ausmass der BITREx-Antwort mit der anfänglichen Länge des CUP1-Genarrays verbunden war. Die Rolle von Rtt109 wurde entscheidender, als die Forscher genetische Hintergründe manipulierten, um die Effektivität von BITREx zu erhöhen oder zu verringern.

#Allgemeine Anwendbarkeit von BITREx

Die BITREx-Methode ist nicht auf das CUP1-Gen beschränkt. Sie kann auch mit anderen Genarrays funktionieren, egal ob sie natürlich, ingenieure oder sogar unterbrochen sind. Forscher testeten BITREx an verschiedenen tandemartigen Arrays, was sich als erfolgreich erwies, um die Genkopien zu erweitern.

Experimente mit Genarrays, die fluoreszierende Proteine kodieren, zeigten, dass BITREx ein effektives Werkzeug zur Verbesserung der Genexpression in ingenieure Konstrukten sein könnte. Dies könnte besonders nützlich in der Biotechnologie und Medizin sein, wo eine höhere Gen-Dosierung von Vorteil sein könnte.

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass BITREx sowohl in Hefe als auch in Säugetierzellen funktioniert. In menschlichen Zellen wurde BITREx erfolgreich auf ein Reporter-Konstrukt angewendet, das entworfen wurde, um die EGFP-Genkopien zu erhöhen. Nach der Induktion des BITREx-Prozesses beobachteten die Forscher eine Zunahme der EGFP-Fluoreszenz, was bestätigte, dass die Methode auch ausserhalb von Hefe effektiv war.

#Erweiterung natürlicher Genarrays

Die Forscher konzentrierten sich auch auf natürlich vorkommende Genarrays beim Menschen, insbesondere auf das D4Z4-Array, das mit einer genetischen Erkrankung namens facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD) verbunden ist. Sie wollten herausfinden, ob BITREx die Anzahl der Kopien dieses Genarrays erhöhen könnte, was Auswirkungen auf potenzielle Gentherapien hätte.

Indem sie spezifische Sequenzen im D4Z4-Array mit ihrem modifizierten Cas9 anvisierten, fanden sie heraus, dass sie die Genkopien in kultivierten menschlichen Zellen erhöhen konnten. Dieser erste Erfolg deutet darauf hin, dass BITREx eine nützliche Methode zur Modifikation von Genarrays in verschiedenen Organismen sein könnte.

#Fazit

BITREx stellt einen bedeutenden Fortschritt im Bereich der Gentechnik dar. Indem es Wissenschaftlern ermöglicht, Genarrays durch gezielte Manipulation zu erweitern, eröffnet es neue Möglichkeiten für Forschung und Anwendungen in der Biotechnologie.

Der Prozess zeigt die Komplexität und Anpassungsfähigkeit genetischer Strukturen und veranschaulicht, wie verschiedene Faktoren-wie Genkopienanzahl, Umweltbedingungen und epigenetische Modifikationen-interagieren, um die Genexpression und Evolution zu beeinflussen. Forscher sind optimistisch, dass BITREx zu innovativen Lösungen in der Medizin, Landwirtschaft und synthetischen Biologie führen kann, wodurch es ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis und zur Nutzung der Macht der Genetik wird.

Mit dem Fortschritt der Wissenschaft werden das volle Potenzial und die Grenzen von BITREx deutlicher. Eine kontinuierliche Erforschung in diesem Bereich wird wahrscheinlich aufregende neue Erkenntnisse über Gen-Duplikationen und deren Anwendungen zur Lösung realer Probleme liefern. Die Reise zum Verständnis und zur Nutzung von BITREx hat gerade erst begonnen, aber ihre Auswirkungen sind riesig und vielversprechend.