Untersuchung der Withanolid-Biosynthese in Pflanzen

Pflanzen haben eine erstaunliche Fähigkeit, komplexe Verbindungen zu erzeugen, die die Gesundheit beeinflussen können. Einige dieser Verbindungen nennt man spezialisierte Metaboliten. Obwohl Forscher schon tief in die Chemikalien hineingeschaut haben, die Pflanzen produzieren, verstehen sie immer noch nicht komplett, wie die Gene in Pflanzen funktionieren, um diese Stoffe zu erzeugen. Diese Wissenslücke macht es schwer, Pflanzen für medizinische Zwecke zu verbessern oder sie mit Mikroorganismen herzustellen.

Eine interessante Gruppe von spezialisierten Metaboliten nennt sich Withanolide. Diese Verbindungen gehören zur Nachtschattenfamilie, zu der bekannte Arten wie Tomaten und Kartoffeln zählen. Withanolide findet man hauptsächlich in der Pflanze Withania somnifera, besser bekannt als Ashwagandha. Diese Pflanze wird seit langem in der traditionellen Medizin verwendet, besonders in der indischen Ayurveda-Praxis. Neueste Studien zeigen, dass Ashwagandha helfen kann, Stress abzubauen, was die lange Anwendung in traditionellen Heilmethoden unterstützt.

Trotz ihrer Nützlichkeit haben Forscher bisher nur ein spezifisches Enzym identifizieren können, das an der Herstellung von Withanoliden beteiligt ist, was ein Engpass für Wissenschaftler darstellt, die verstehen wollen, wie diese Verbindungen entstehen. Das Enzym, bekannt als Sterol Δ24-Isomerase (24ISO), verwandelt eine Vorstufe in eine andere Form, die entscheidend für die Produktion von Withanoliden ist. Die Schritte, die auf diese erste Reaktion folgen, sind jedoch noch nicht gut verstanden.

#Die Herausforderung, den Pflanzenstoffwechsel zu verstehen

Herauszufinden, wie Pflanzen spezialisierte Metaboliten erzeugen, war traditionell ein langsamer Prozess. In den letzten zwei Jahrzehnten haben Fortschritte in der Technologie jedoch den Prozess beschleunigt, wie Pflanzen-Gene funktionieren. Wissenschaftler nutzen jetzt häufig Transkriptomdaten, die die Genexpression in verschiedenen Teilen einer Pflanze und in verschiedenen Wachstumsphasen untersuchen, um Gene zu finden, die an der Produktion dieser speziellen Verbindungen beteiligt sind. In der Vergangenheit wurde genomische Daten oft übersehen, aber das ändert sich, da mehr Pflanzen-Genome sequenziert werden.

Viele Pflanzenarten haben Gencluster, das sind Gruppen von Genen, die in biosynthetischen Stoffwechselwegen zusammenarbeiten. Das hat Wissenschaftlern geholfen, herauszufinden, wie bestimmte Verbindungen hergestellt werden. Beispielsweise wurden ähnliche Genanordnungen für eine Vielzahl von Pflanzenmetaboliten entdeckt, darunter Saponine und Alkaloide.

Im Fall der Biosynthese von Withanoliden haben Forscher zuvor vorgeschlagen, dass 24ISO möglicherweise mit anderen Genen, die mit spezialisiertem Stoffwechsel in Verbindung stehen, clustering könnte. Ein Mangel an hochwertigen Genomsequenzen hat jedoch ihre Analyse eingeschränkt. Jüngste Verbesserungen in der Genomsequenzierung haben es möglich gemacht, Gencluster in Pflanzen besser zu untersuchen.

#Untersuchung der Withanolid-Produktion

Withania somnifera ist als Produzent von Withanoliden bekannt, und Forscher haben eine vollständige Genomeassemblierung dieser Pflanze erstellt. Diese Assemblierung enthält Informationen über mehr als 35.000 Gene und bietet einen detaillierteren Blick auf die Gene, die an der Produktion von Withanoliden beteiligt sind. Durch den Vergleich dieses Genoms mit denen anderer verwandter Pflanzen fanden die Wissenschaftler heraus, dass bestimmte Gene, einschliesslich 24ISO, zusammen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise im selben biosynthetischen Weg zusammenarbeiten.

Trotz des Fortschritts im Verständnis der genetischen Grundlagen von Withanoliden bleiben die Schritte, die auf die Aktivität des Enzyms 24ISO folgen, unklar. Forscher haben angedeutet, dass viele Gene und Enzyme, die an den späteren Stadien der Withanolid-Biosynthese beteiligt sind, noch unbekannt sind. Um diese Herausforderung zu bewältigen, testeten Wissenschaftler mehrere potenzielle Kandidatengene mit einer Gene-Silencing-Technik namens virus-induziertes Gen-Silencing, aber es wurde keine klare Aktivität gefunden.

#Die Rolle von Cytochrom P450-Enzymen

Eine wichtige Gruppe von Enzymen, die an verschiedenen pflanzlichen Stoffwechselprozessen teilnehmen, sind Cytochrom P450-Monooxygenasen. Diese Enzyme spielen eine Schlüsselrolle bei der Synthese vieler Pflanzenverbindungen, einschliesslich Triterpenoide und Steroide. Einige spezifische Familien von Cytochrom P450-Enzymen sind besonders mit der Produktion von Triterpenoiden verbunden.

Als die Forscher sich genauer mit dem Gencluster rund um das 24ISO-Enzym beschäftigten, fanden sie zahlreiche Cytochrom P450-Gene. Die Gruppierung dieser Gene unterstützt die Idee, dass sie im Weg zur Produktion von Withanoliden zusammenarbeiten. Einige neuere Studien hatten vorgeschlagen, dass bestimmte Cytochrom P450-Enzyme möglicherweise an der Biosynthese von Withanoliden beteiligt sind, aber ihre genauen Rollen wurden noch nicht bestätigt.

#Stoffwechsel-Engineering zur Produktion von Zwischenprodukten

Um das Verständnis der Withanolid-Biosynthese voranzubringen, zielten die Wissenschaftler darauf ab, ein System zu schaffen, das die Produktion von 24-Methyl-desmosterol, einem wichtigen Zwischenprodukt im Stoffwechselweg, ermöglichte. Indem sie dieses System in Hefe konstruierten, löschten sie bestimmte Gene im Sterolweg der Hefe, um dessen Stoffwechsel auf die Produktion von 24-Methyl-desmosterol umzuleiten. Dieser Ansatz ermöglichte es den Forschern, die Funktion zusätzlicher Gene zu erforschen, die möglicherweise an diesem Weg beteiligt waren.

Nach ersten Versuchen, die Hefe zu verändern, gelang es den Forschern, 24-Methyl-desmosterol in signifikanter Menge erfolgreich herzustellen. Während dieses Prozesses entdeckten sie jedoch auch andere Verbindungen, die nicht das gewünschte Produkt waren. Eine weitere Optimierung der Hefestämme führte zu höheren Produktionsniveaus von 24-Methyl-desmosterol und gleichzeitig zu einer Minimierung der unerwünschten Nebenprodukte.

#Übergang zu pflanzenbasierten Systemen

Obwohl das Hefesystem nützlich war, erkannten die Wissenschaftler, dass der Transfer des Stoffwechselweges in ein pflanzenbasiertes System, wie Nicotiana benthamiana, zusätzliche Vorteile bieten könnte. Pflanzen sind bereits in der Lage, einige der Vorstufen, die für die Synthese von Withanoliden benötigt werden, zu produzieren, was den Prozess des Stoffwechsel-Engineerings vereinfachen könnte.

Die Forscher versuchten, das 24ISO-Enzym in Nicotiana benthamiana zu exprimieren. Die ersten Ergebnisse waren jedoch nicht vielversprechend. Dies führte zu weiteren Anpassungen, einschliesslich der Stilllegung bestimmter Gene, die die Produktion des Vorprodukts hemmen, um eine bessere Ansammlung von 24-Methyl-desmosterol zu ermöglichen.

Nach mehreren Versuchen gelang es dem Team, die Produktionsniveaus in Nicotiana benthamiana zu erhöhen, indem sie mehrere Gene, die den gesamten Phytosterol-Weg bilden, gemeinsam exprimierten. Dies war ein Erfolg, der die Fähigkeit von Pflanzen hervorhob, pflanzenähnliche Sterole effektiv zu produzieren.

#Aufklärung des Biosyntheseweges

Nachdem die Systeme zur Produktion von Schlüsselzwischenprodukten etabliert waren, wandten sich die Forscher der Identifizierung der nächsten Enzyme zu, die für die Biosynthese von Withanoliden benötigt werden. Sie konzentrierten sich auf die Cytochrom P450-Enzyme, die im Gencluster vorhanden waren, da diese die wahrscheinlichsten Kandidaten waren, um kritische Umwandlungen im Weg zu katalysieren.

Durch das Screening dieser Enzyme fanden sie heraus, dass spezifische Kombinationen von Cytochrom P450s zur Produktion verschiedener hydroxylierten Verbindungen führten, was darauf hindeutet, dass der Weg in Richtung der Bildung von Withanolid-Strukturen voranschritt. Die Ergebnisse deuteten auf einen mehrstufigen Oxidationsprozess zur Assemblierung des charakteristischen Laktonrings hin, der in Withanoliden vorhanden ist.

#Fazit

Die Forschung zur Biosynthese von Withanoliden hat ein komplexes Netz von genetischen Wechselwirkungen und enzymatischen Aktivitäten aufgedeckt. Die Identifizierung des Genclusters, der für die Produktion von Withanoliden verantwortlich ist, eröffnet neue Wege, um unser Verständnis des Pflanzenstoffwechsels zu erweitern.

Durch sowohl Hefe- als auch pflanzenbasierte Systeme haben Wissenschaftler Fortschritte bei der Produktion von Schlüsselzwischenprodukten und der Identifizierung der Enzyme gemacht, die für die weiteren Reaktionen verantwortlich sind. Die laufende Arbeit in diesem Bereich trägt nicht nur zum Wissen über Withanolide bei, sondern hebt auch das Potenzial hervor, Pflanzen so zu reformieren, dass sie nützliche Verbindungen für medizinische Anwendungen produzieren.

Der Weg von traditionellen medizinischen Anwendungen zur modernen Arzneimittelentwicklung ist lang, aber die Erkenntnisse aus der Untersuchung der Withanolid-Biosynthese könnten den Weg für zukünftige Fortschritte auf dem Gebiet der pflanzenbasierten Arzneimittel ebnen. Während die Forschung fortschreitet, gibt es Hoffnung, das Verständnis des spezialisierten Stoffwechsels in Pflanzen zu verbessern, was letztendlich zu optimierten Produktionssystemen und therapeutischen Mitteln führen könnte.