Proteinimport in Mitochondrien: Wichtige Mechanismen

In eukaryotischen Zellen müssen Proteine sortiert und an die richtigen Orte innerhalb der Zelle geschickt werden, damit sie richtig funktionieren. Die meisten Proteine werden im Zellkern hergestellt, aber sie erledigen ihre Aufgaben in bestimmten Bereichen. Zum Beispiel müssen Mitochondrien, die Kraftwerke der Zelle sind, eine grosse Menge verschiedener Proteine importieren, um richtig zu funktionieren. Diese Proteine haben spezielle Signale, die ihnen helfen, ihr Ziel zu erreichen.

#Mitochondrialer Importprozess

Ein wichtiger Eingangspunkt für Proteine in die Mitochondrien ist ein Komplex namens Translokase der äusseren Mitochondrienmembran, kurz TOM. Dieser Komplex besteht aus mehreren Teilen. Die Hauptkomponente heisst TOM40, die ein Loch bildet, durch das Proteine hindurch gelangen können. Es gibt auch andere Teile wie TOM22, die helfen, Proteine zu erkennen und zu binden, die importiert werden müssen.

Zwei zusätzliche Teile, TOM20 und TOM70, sind wichtig, weil sie unterschiedliche Signale auf den Proteinen erkennen. TOM20 arbeitet hauptsächlich mit Proteinen, die für die innere Mitochondrienmembran oder die Matrix bestimmt sind. TOM70 hingegen bevorzugt Proteine mit einer speziellen Struktur namens alpha-helikal, die normalerweise für die äussere oder innere Mitochondrienmembran gedacht sind.

TOM70 bleibt nicht so fest mit dem Kernkomplex verbunden wie TOM20. Es erscheint normalerweise als Homodimer, was bedeutet, dass es aus zwei identischen Einheiten besteht. Wenn TOM20 auseinanderbricht, zeigt es immer noch eine starke Präsenz im Komplex, bewegt sich aber anders in Tests, die helfen, die Proteinstrukturen zu visualisieren.

Um die Proteine an diese Eintrittspunkte zu bringen, sind andere Helfer, sogenannte Chaperone, erforderlich. Diese Chaperone sorgen dafür, dass die Proteine nicht zusammenkleben und ihren Weg zum TOM-Komplex finden können.

Während Wissenschaftler allgemein glauben, dass die meisten Proteine importiert werden, nachdem sie hergestellt wurden, gibt es einige Hinweise, dass Proteine möglicherweise auch in der Nähe der Mitochondrien hergestellt werden. Diese Idee kommt daher, dass man Ribosomen, die die Orte der Proteinbiosynthese sind, rund um die Mitochondrien beobachtet hat. Einige Experimente haben sogar gezeigt, dass bestimmte Messenger-RNAs (MRNAs) in der Nähe der Mitochondrien zu finden sind, was darauf hindeutet, dass Proteine vor Ort hergestellt werden könnten.

#Rolle von RNA-bindenden Proteinen

RNA-bindende Proteine (RBPs) spielen eine wichtige Rolle in diesem Prozess. Sie können steuern, wohin mRNAs gehen, wie stabil sie sind und ob sie in Proteine übersetzt werden. Zum Beispiel hilft ein RBP namens Puf3p in Hefe, mRNAs zu den Mitochondrien zu lenken. Bei Säugetieren helfen zwei gut untersuchte RBPs, CLUH und SYNJ2BP, die mRNAs zu steuern, die mitochondrialen Proteine codieren.

Wenn CLUH entfernt wird, sinkt die Menge der Proteine, die aus seinen Ziel-mRNAs hergestellt werden, was zu Problemen mit der Form der Mitochondrien führt. SYNJ2BP stellt sicher, dass seine Ziel-mRNAs an ihrem Platz bleiben, besonders wenn die Translation unter Stress steht. SYNJ2BP spielt auch eine Rolle bei der lokalen Translation, die hilft, die mitochondriale Funktion aufrechtzuerhalten.

#Untersuchung der TOM-Komplex-Interaktionen

Um besser zu verstehen, wie TOMM20 und TOMM70 mit anderen Proteinen interagieren, verwendeten Wissenschaftler eine Methode namens APEX2-Proximitätsmarkierung. Diese Methode hilft, herauszufinden, welche Proteine in der Nähe sind und miteinander interagieren. Indem sie ein kleines Etikett an TOMM20 oder TOMM70 anbrachten, konnten sie genau bestimmen, welche Proteine spezifisch mit jedem Rezeptor assoziiert waren.

Sie erzeugten zwei Arten von Fusionsproteinen, TOMM20-APEX2 und TOMM70-APEX2, und führten diese in HeLa-Zellen ein, die häufig in Laboruntersuchungen verwendet werden. Sie stellten sicher, dass diese Proteine korrekt in den Mitochondrien lokalisiert waren, was bestätigte, dass ihre Methode wie gewünscht funktionierte.

#Funktionale Validierung der Fusionsproteine

Um sicherzustellen, dass die Fusionsproteine richtig funktionierten, verwendeten die Wissenschaftler verschiedene Methoden. Sie suchten nach der Anwesenheit ihrer markierten Proteine in den Mitochondrien und bewerteten, ob sie negative Auswirkungen auf die mitochondriale Funktion verursachten.

Sie fanden heraus, dass beide Fusionsproteine mit den Schlüsselteilen des TOM-Komplexes interagierten. Weitere Tests zeigten, dass TOMM20-APEX2 signifikant vorhanden war, als es aus dem TOM-Komplex gezogen wurde, was bestätigte, dass die Fusionsproteine richtig integriert waren.

#Biotinylierungsaktivität der Fusionsproteine

Als nächstes testeten die Forscher, ob diese Fusionsproteine Biotinylierung durchführen konnten, ein Prozess, bei dem ein kleines Molekül namens Biotin an Proteine angehängt wird, um sie zur Identifizierung zu markieren. Als beide Fusionsproteine unter spezifischen Bedingungen exprimiert wurden, konnten sie zusätzliche Proteine markieren, was darauf hindeutet, dass die Fusionsproteine aktiv waren.

Interessanterweise war die Biotinmarkierung nicht nur auf mitochondriale Proteine beschränkt; sie schien auch Proteine im umgebenden Zytoplasma zu beeinflussen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Fusionsproteine möglicherweise einen Einfluss über ihren unmittelbaren Bereich hinaus haben.

#Analyse der Proteininteraktionen

Nachdem die Fusionsproteine bestätigt wurden, suchten die Wissenschaftler nach den Interaktionen von TOMM20-APEX2 und TOMM70-APEX2 mit anderen Proteinen. Sie verglichen die identifizierten Proteinsätze unter verschiedenen Bedingungen, einschliesslich Kontrollen, bei denen die Fusionsproteine nicht exprimiert wurden.

Insgesamt identifizierten sie über 2.000 verschiedene Proteine, von denen viele mit mitochondrialen Funktionen assoziiert waren. Die Analyse zeigte, dass es erhebliche Interaktionen mit Proteinen aus dem Zytoplasma und sogar einigen aus dem Zellkern gab.

Interessanterweise war TOMM20 mit vielen RBPs und proteinhaltigen Proteinen, die mit der Translation in Zusammenhang stehen, verbunden, während TOMM70 hauptsächlich mit membranbounden Organellen assoziiert war. Dieser Unterschied deutet darauf hin, dass TOMM20 möglicherweise eine bedeutendere Rolle in lokalen Übersetzungsprozessen hat als TOMM70.

#Unterschiedliche Interaktionen unter Stressbedingungen

Um zu verstehen, wie sich die Interaktome unter Bedingungen von Translationsstress veränderten, behandelten die Wissenschaftler die Zellen mit einem Translationshemmer namens Puromycin. Sie fanden heraus, dass trotz des Stresses viele Interaktionen bestehen blieben, obwohl einige Proteine unter diesen Bedingungen in grösserer Menge vorhanden waren.

Bei der Untersuchung, welche Proteine nach der Translationshemmung häufiger auftauchten, identifizierten sie mehrere translationsbezogene Proteine. Dies deutet darauf hin, dass TOMM20 eine Rolle bei der Stabilität von mRNAs während stressiger Zeiten spielen könnte.

#Fazit

Die durchgeführten Arbeiten liefern Einblicke, wie TOMM20 und TOMM70 Rezeptoren verschiedene Proteinsätze in den Mitochondrien verwalten. Die Studie bestätigt, dass diese Rezeptoren mit einzigartigen, aber manchmal überlappenden Sätzen von mitochondrialen Präproteinen interagieren, was Parallelen zu ihren Gegenstücken in Hefe zieht.

Die Ergebnisse unterstützen auch die Idee, dass TOMM20 in lokale Übersetzungsprozesse an der äusseren Mitochondrienmembran involviert ist. Das Verständnis dieser Interaktionen vertieft nicht nur das Wissen über die mitochondriale Funktion, sondern könnte auch Implikationen dafür haben, wie Zellen auf Stress reagieren und ihre Gesundheit aufrechterhalten.

Die Forschung hebt die Komplexität der Proteinverteilung und die entscheidende Rolle der Mitochondrien in der Zellfunktion hervor und bildet eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen zur mitochondrialen Biologie und ihrer Relevanz für verschiedene Krankheiten.

#Übersicht der Methodik

#Zellkultur

Die Forscher hielten HeLa 11ht-Zellen in einem spezifischen Wachstumsmedium, wobei sie sorgfältige Protokolle befolgten, um ein gesundes Wachstum und genaue Ergebnisse während der Experimente sicherzustellen.

#Plasmid-Konstruktion

Mit fortschrittlichen Techniken erstellten sie Plasmide, die die Integration der Fusionsproteine in die HeLa-Zellen ermöglichen sollten. Dieser Schritt war entscheidend, um die richtige Expression von TOMM20 und TOMM70 sicherzustellen.

#Erzeugung stabiler Zelllinien

Um Zelllinien zu erzeugen, die konstant die APEX2-Fusionsproteine exprimierten, verwendeten die Wissenschaftler ein Verfahren, das die Integration von Genen in die DNA der Zelle sicherstellt.

#Immunfluoreszenz und Zellfraktionierung

Das Team führte verschiedene Labortechniken durch, einschliesslich immunfluoreszenz Mikroskopie, um die Lokalisierung der Fusionsproteine zu visualisieren und zu bestätigen. Sie fraktionierten auch die Zellen, um mitochondriale und zytoplasmatische Komponenten für weitere Analysen zu trennen.

#Proximitätsmarkierung

Durch die induzierte Biotinylierung unter kontrollierten Bedingungen konnten sie die Proteine erfassen und analysieren, die in der Nähe des TOM-Komplexes interagierten. Diese Methodik ist entscheidend, um die lokale Umgebung um mitochondriale Rezeptoren zu verstehen.

#Massenspektrometrie-Analyse

Schliesslich unterzogen sich die durch Proximitätsmarkierung erfassten Proteine einer hochentwickelten Massenspektrometrie-Analyse, um ihre Identitäten zu bestimmen. Dies ermöglichte signifikante Einblicke in die Interaktionen von TOMM20 und TOMM70 in verschiedenen zellulären Kontexten.

Diese Kombination von Techniken gibt einen umfassenden Überblick über die komplexen Interaktionen, die in den mitochondrialen Importwegen ablaufen, und ebnet den Weg für ein besseres Verständnis der mitochondrialen Dynamik.