Fortschritte in korrelativen Mikroskopietechniken

Korrelierende Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist 'ne Methode, um Zellen und deren Teile ganz nah anzuschauen. Dabei werden zwei Arten von Bildgebung kombiniert: Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie. Jede Methode hat ihre eigenen Stärken und Schwächen. Lichtmikroskopie ist super, um lebende Zellen zu beobachten und ihr Verhalten zu sehen, während die Elektronenmikroskopie sehr detaillierte Bilder von der Zellstruktur liefert. Durch die Kombination beider Methoden ermöglicht CLEM Forschern, seltene Ereignisse in der Biologie mit hohem Detail und Kontext zu studieren.

#Wie funktioniert die Lichtmikroskopie

Die Lichtmikroskopie nutzt Licht, um Proben zu beleuchten, sodass Wissenschaftler Strukturen auf zellulärer Ebene sehen können. Forscher markieren oft wichtige Moleküle in lebenden Zellen mit speziellen, farbigen Proteinen, die leuchten, wenn sie von speziellem Licht getroffen werden. Dieses Leuchten ermöglicht es ihnen zu sehen, wie diese Moleküle interagieren, während die Zellen verschiedene Aktivitäten durchlaufen. Aufgrund der Art, wie Licht funktioniert, kann die Lichtmikroskopie jedoch nur Details auflösen, die etwa 200 Nanometer auseinanderliegen. Das bedeutet, dass sie grosse Strukturen sehen können, aber oft die kleineren, feineren Details in den Zellen übersehen.

#Einschränkungen der Lichtmikroskopie

Obwohl es Methoden gibt, die die Auflösung der Lichtmikroskopie verbessern können, benötigen sie oft spezielle Geräte und sorgfältige Probenvorbereitung, was ihre Verwendung einschränken kann. Ausserdem konzentriert sich die Lichtmikroskopie normalerweise auf bestimmte Moleküle und zeigt oft nicht die umgebenden Strukturen innerhalb der Zellen. Das kann es schwierig machen zu verstehen, wie diese Moleküle ins Gesamtbild der Zellorganisation passen.

#Vorteile der Elektronenmikroskopie

Elektronenmikroskopie überwindet viele Einschränkungen der Lichtmikroskopie. Sie erreicht eine viel höhere Auflösung, sodass Forscher feinere Details der Zellstruktur sehen können. Die Elektronenmikroskopie hat jedoch in der Regel ein kleineres Sichtfeld, was bedeutet, dass sie zwar viele Details in einem kleinen Bereich zeigt, nicht aber den grösseren Kontext so effektiv erfassen kann.

#Was CLEM bietet

CLEM kombiniert Licht- und Elektronenmikroskopie und nutzt die Stärken beider Methoden, während sie ihre Schwächen umgeht. Dieser Ansatz hat zu bedeutenden Entdeckungen in der Biologie geführt, wie der Struktur von Tunneln in Neuronen, der Verschmelzung von Blutgefässen in Zebrafischen und der Lokalisierung von Tuberkulosebakterien in menschlichen Zellen.

#Schritte in CLEM

Eine gängige Methode zur Durchführung von CLEM umfasst zwei Hauptschritte: zuerst Bilder mit Lichtmikroskopie aufnehmen, dann mit Elektronenmikroskopie.

1. Probenvorbereitung: Hierbei werden die interessierenden Strukturen mit fluoreszierenden Farbstoffen oder Proteinen markiert, wodurch Forscher einen Stapel von Bildern durch die Probe erstellen können.
2. Bildaufnahme mit Lichtmikroskopie: Forscher fertigen eine Serie von Bildern an, die einen Blick darauf geben, wie sich die markierten Strukturen in Echtzeit verhalten.
3. Vorbereitung für die Elektronenmikroskopie: Die Probe wird behandelt, um ihre Struktur zu erhalten, mit schweren Metallen gefärbt, um Kontraste zu erzeugen, und dann in Harz eingebettet.
4. Bildaufnahme mit Elektronenmikroskopie: Dünne Scheiben der Probe werden geschnitten, um detaillierte Bilder zu erfassen, was zu einer Serie von Bildern führt, die einen hochauflösenden Blick auf die Strukturen bieten.

Nach der Bildaufnahme existieren zwei Bildstapel: einer von der Lichtmikroskopie und einer von der Elektronenmikroskopie. Die Herausforderung besteht nun darin, diese beiden Bildsätze so auszurichten, dass die Daten beider Methoden übereinstimmen, um eine angemessene Analyse zu ermöglichen.

#Bilder ausrichten

Die Ausrichtung der beiden Bildsätze kann knifflig sein, da es Unterschiede in Auflösung, Kontrast und der Art und Weise gibt, wie die Bilder aufgenommen wurden. Um die beiden Datensätze zu verstehen, müssen Forscher einen Weg finden, sie genau auszurichten. Es gibt zwei Hauptmethoden dafür:

1. Bilder verarbeiten: Eine Möglichkeit ist, eines oder beide Bilder so anzupassen, dass sie ähnlich aussehen. Sobald sie ähnlich erscheinen, können traditionelle Methoden, die in der medizinischen Bildgebung verwendet werden, angewendet werden, um sie automatisch auszurichten.
2. Landmarken verwenden: Die zweite Methode besteht darin, spezifische Merkmale auszuwählen, die in beiden Bildgebungstechniken sichtbar sind. Durch das Identifizieren und Markieren dieser Merkmale in beiden Datensätzen können Forscher berechnen, wie eines der Bildsätze transformiert werden muss, um mit dem anderen übereinzustimmen.

#Herausforderungen bei der Ausrichtung

Beide Methoden zur Ausrichtung von Bildern haben ihre Herausforderungen. Die erste Methode, die Bilder verarbeitet, um sie ähnlicher aussehen zu lassen, kann effektiv sein, erfordert jedoch viel Vorarbeit. Die zweite Methode, die Landmarken verwendet, ist manuell und kann mühsam sein, viel Zeit in Anspruch nehmen und möglicherweise Bias einführen, da die Merkmale, die zur Ausrichtung gewählt werden, ähnlich wie die zu studierenden sein könnten. Daher ist es sehr wünschenswert, Wege zu finden, die Identifizierung von Landmarken zu automatisieren.

#Neuer Workflow für CLEM

Um die genannten Probleme anzugehen, wurde ein neuer Workflow entwickelt, um Mitochondrien zu segmentieren, die in Zellen reichlich und verbreitet sind. Dieser Schritt hilft, übereinstimmende Strukturen zwischen Bildern der Licht- und Elektronenmikroskopie zu finden. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um die Bilder zu segmentieren, von traditioneller Bildverarbeitung bis hin zu fortgeschrittenen Techniken des maschinellen Lernens.

Nach der Segmentierung der Mitochondrien werden Punkte aus diesen Segmentierungen entnommen, um eine „Punktwolke“ für jede Bildgebungsmodalität zu erstellen. Punktwolken sind eine Möglichkeit, die Daten darzustellen, die die Menge an Informationen reduziert, die bearbeitet werden muss, was die Effizienz verbessert.

#Registrierung von Punktwolken

Sobald die Punktwolken erstellt sind, können sie mit modernen Techniken ausgerichtet werden. Eine solche Methode, die Coherent Point Drift (CPD) genannt wird, ermöglicht es, die Ausrichtungsaufgabe als Wahrscheinlichkeitsproblem zu behandeln, was bedeutet, dass eine strenge Eins-zu-Eins-Zuordnung zwischen den Punkten nicht notwendig ist.

Der gesamte Prozess läuft als Plugin für einen Bildbetrachter namens napari. Dieses Plugin bietet eine einfache Möglichkeit für Nutzer, die Ausrichtung mit einem Knopfdruck durchzuführen oder bei Bedarf Anpassungen an spezifischen Schritten im Workflow vorzunehmen.

#Testen der neuen Methode

Um zu sehen, wie gut diese neue Methode funktioniert, wurden Benchmark-Datensätze von HeLa-Zellen verwendet. Diese Datensätze ermöglichen Vergleiche mit Expertenausrichtungen, um die Leistung der neuen Methode zu bewerten.

Für die Bewertungen wurden wichtige Strukturen identifiziert, die nicht in die Registrierung einflossen, und die Überlappung zwischen den segmentierten Strukturen aus den beiden Modalitäten wurde gemessen. Eine Metrik namens wahrer positiver Satz (TPR) wurde verwendet, um zu quantifizieren, wie gut sich die beiden Bilder ausrichten. Die Ergebnisse zeigten, dass die automatisierte Methode eine Ausrichtung erzielte, die nahe an der Leistung von Experten lag.

#Zugänglichkeit und Benutzerfreundlichkeit

Das napari-Plugin macht diese neue Methode einer breiteren Nutzergruppe zugänglich, einschliesslich derjenigen, die möglicherweise keine Experten in der Mikroskopie sind. Die Benutzeroberfläche ermöglicht schnelle Operationen, bietet aber auch Optionen, um zwischenschritte des Prozesses anzusehen und anzupassen.

Benutzer können Parameter einfach anpassen und sehen, wie sich Änderungen auf das Ergebnis auswirken, oder sogar ihre eigenen Segmentierungen aus verschiedenen Quellen verwenden, was der Workflow flexibel macht.

#Zukünftige Perspektiven

Obwohl der neue CLEM-Workflow grosses Potenzial zeigt, gibt es noch Herausforderungen zu überwinden. Eine besteht darin, bessere automatisierte Methoden zur Segmentierung von Organellen in der Elektronenmikroskopie zu entwickeln. Methoden und Werkzeuge, die es einfacher machen, Deep-Learning-Modelle zu trainieren, sind im Kommen, sodass Forscher die Leistung verbessern können, ohne umfangreiche Datensätze von Grund auf zu benötigen.

Eine weitere Herausforderung ist die Grösse von Bioimaging-Datensätzen. Wenn diese Datensätze wachsen, werden Methoden, um grössere Datenmengen zu handhaben, ohne auf Computer-Speicherprobleme zu stossen, unerlässlich sein.

Die Optimierung des Workflows für schnellere Verarbeitungszeiten, insbesondere durch die Einbeziehung von GPU-Beschleunigung, ist ebenfalls ein zukünftiges Ziel.

#Fazit

CLEM ist eine leistungsstarke Technik, die Licht- und Elektronenmikroskopie zusammenbringt, um einen umfassenden Blick auf biologische Strukturen und Prozesse zu gewinnen. Der neue automatisierte CLEM-Workflow, der von fortgeschrittenen Segmentierungs- und Punktwolkenmethoden angetrieben wird, eröffnet Möglichkeiten für umfangreiche Forschung in vielen biologischen Bereichen. Indem dieses Verfahren benutzerfreundlicher Software für verschiedene Nutzer zugänglich gemacht wird, hat es das Potenzial, unser Verständnis komplexer biologischer Systeme zu verbessern.

Letztendlich wird CLEM, mit laufenden Entwicklungen in der Bildgebung, Verarbeitungstechniken und maschinellem Lernen, weiterhin evolvieren und tiefere Einblicke in die faszinierende Welt der Zellen und ihrer Komponenten bieten.