Avanços nas Técnicas de Triagem CRISPR

Os screens pooled CRISPR são uma maneira rápida e econômica de descobrir quais genes têm um papel em funções biológicas específicas. O procedimento padrão envolve a produção de lentivírus que carregam um RNA guia único (sgRNA) que mira em um gene de interesse. Depois que os vírus são entregues nas células, cada célula é infectada por no máximo um vírus, resultando no knockout de um gene aleatório. As células são então selecionadas com base nas mudanças em suas características após o knockout do gene. Para identificar qual sgRNA foi responsável por essas mudanças, os cientistas extraem o material genético das células, amplificam a sequência do sgRNA e a analisam usando sequenciamento de alto rendimento.

#Os Fundamentos da Amplificação de sgRNA do CRISPR

Uma parte importante do processo é a amplificação do sgRNA do CRISPR, que pode ser feita usando sondas de inversão molecular (MIPS). Essa técnica oferece melhor especificidade e sensibilidade, permitindo que os pesquisadores capturem e analisem o sgRNA de forma mais eficaz.

#Desafios em Screens Pooled CRISPR

Apesar de os screens pooled CRISPR serem poderosos, realizá-los não é sem desafios. O sucesso depende de vários aspectos técnicos, como o quão bem os vírus podem infectar as células-alvo e quão eficientemente podem editar genes. Esses desafios são especialmente notáveis ao trabalhar com células primárias. Além disso, ter um número limitado de SgRNAs para quantificar pode dificultar a análise estatística.

Para lidar com alguns desses problemas, os cientistas desenvolveram métodos computacionais aprimorados e vírus de rastreamento de linhagem para acompanhar melhor quais genes estão sendo eliminados. No entanto, gerar bibliotecas virais complexas tem se mostrado uma tarefa desafiadora, e erros podem ocorrer durante os processos de clonagem e transfecção.

#Foco na Amplificação PCR

Nossa pesquisa examina uma preocupação específica: o efeito da amplificação PCR de sgRNAs na confiabilidade dos resultados estatísticos em screens CRISPR. A amplificação PCR típica pode não representar com precisão o número real de células. Como o mesmo sgRNA pode ser copiado várias vezes durante a PCR, as leituras resultantes se tornam interdependentes, o que complica a modelagem estatística.

Essa dependência viola suposições estatísticas comuns, então precisamos encontrar uma maneira melhor de analisar os dados. Uma técnica usando identificadores moleculares únicos (UMIs) pode ajudar com isso, permitindo que os pesquisadores distinguam leituras que se originam do mesmo sgRNA. No entanto, adicionar UMIs aos protocolos PCR padrão não é simples.

#Introduzindo MIPs

Em vez da abordagem PCR convencional, propomos usar a amplificação baseada em MIP. Os MIPs permitem uma segmentação altamente específica e eficiente de certos fragmentos de DNA, reduzindo assim o ruído de fundo nos dados finais. Os MIPs têm várias aplicações e agora queremos adaptá-los para screens CRISPR. Nosso novo método provou ser simples e pode substituir os protocolos PCR existentes, facilitando a obtenção de resultados mais precisos.

#Otimização Inicial do Protocolo CRISPR-MIP

Para testar nosso novo método, usamos um modelo de screen CRISPR com um sgRNA em células de câncer pancreático. Através da otimização, estabelecemos que uma quantidade específica de sondas por reação funcionava melhor para a quantidade de células dada. Nosso protocolo final demonstrou alta especificidade, sem ruído de fundo de produtos indesejados.

Também investigamos se a digestão do DNA genômico antes da amplificação MIP poderia melhorar os resultados, mas os benefícios foram menores quando comparamos diferentes preparações de DNA.

#Comparando CRISPR-MIP com PCR Tradicional

A seguir, queríamos avaliar o quão bem nosso método CRISPR-MIP se saía em comparação com a PCR tradicional. Realizamos um screen de dropout usando uma biblioteca que mira em muitos genes de quinase humana. Após preparar bibliotecas de sgRNA usando ambas as técnicas, implementamos um processo de deduplicação personalizado para os dados do CRISPR-MIP.

Nossa análise revelou que o CRISPR-MIP oferece uma saída estatística mais robusta que a PCR, especialmente à medida que a profundidade de sequenciamento aumenta. Enquanto a PCR mostrou tendências inesperadas em sgRNAs significativos, o CRISPR-MIP manteve uma relação consistente entre profundidade de sequenciamento e significância. Isso indicou que a PCR poderia inflacionar estatísticas, levando a resultados não confiáveis.

#Identificando Genes Essenciais

Também analisamos a eficácia do CRISPR-MIP em identificar genes essenciais em comparação com a PCR. Em nossos testes, o CRISPR-MIP descobriu muito mais acertos significativos do que a PCR tradicional. Apesar de poucos acertos de alto nível serem compartilhados entre ambos os métodos, o CRISPR-MIP mostrou maior sensibilidade no geral.

Encontramos diferenças notáveis nas classificações de genes específicos e sua significância, esclarecendo os tipos de genes que a PCR poderia perder. Isso sugere que, enquanto os principais resultados podem ser consistentes entre os dois métodos, o CRISPR-MIP permite detectar genes adicionais relevantes que poderiam passar despercebidos com a PCR.

#Entendendo a Variabilidade na PCR

Ao examinar as diferenças entre CRISPR-MIP e PCR, notamos que ambos os métodos produziram abundâncias de sgRNA semelhantes para certos genes. No entanto, a PCR mostrou maior variabilidade na abundância de sgRNA entre as amostras. Essa variação provavelmente impactou a interpretação estatística geral dos resultados.

Descobrimos que o conteúdo de GC dos sgRNAs teve um efeito significativo na abundância, o que poderia distorcer resultados ao analisar dados da PCR. Baixo conteúdo de GC estava associado a abundâncias mais altas, indicando que a eficácia da PCR poderia ser influenciada pela temperatura de fusão do DNA.

#Implicações do Viés de GC

Nossos achados destacam como o uso de PCR de plasmídeo como referência pode levar a resultados enganosos, particularmente em relação à essencialidade do gene. Quando exploramos grandes conjuntos de dados existentes, vimos evidências de viés de conteúdo de GC afetando a estimativa de genes em vários estudos.

Isso levanta um ponto importante sobre a necessidade de interpretações precisas de screens CRISPR, especialmente em estudos onde a PCR derivada de plasmídeos foi usada como referência. Sugerimos que os pesquisadores sejam cautelosos ao tirar conclusões com base em tais dados e considerem possíveis viéses introduzidos pelos métodos de PCR.

#Recomendações para Implementação do CRISPR-MIP

Nesta pesquisa, conseguimos abordar as questões estatísticas associadas à amplificação de sgRNA durante screens pooled CRISPR. Nosso novo método fornece melhores estatísticas com insights mais precisos, especialmente à medida que a profundidade de sequenciamento aumenta. Isso torna a técnica CRISPR-MIP uma ferramenta valiosa para complementar métodos existentes sem adicionar complexidade.

Além disso, descobrimos a influência do conteúdo de GC nos resultados da PCR e destacamos a necessidade de uma análise cuidadosa desse viés em conjuntos de dados. Para melhorar a integridade da triagem CRISPR, incentivamos os pesquisadores a adotar melhores práticas em seus setups experimentais, incluindo o uso de MIPs para evitar as armadilhas da PCR tradicional.

#Conclusão

Em conclusão, nosso trabalho demonstra que o CRISPR-MIP pode fornecer resultados mais confiáveis e sensíveis em comparação com métodos de PCR tradicionais. Embora ambas as técnicas identifiquem insights genéticos valiosos, a implementação de MIPs oferece uma solução para muitas das limitações impostas pelas abordagens de amplificação convencionais, especialmente em relação à robustez estatística e ao enfrentamento de viéses na representação de genes.

Acreditamos que, à medida que a tecnologia CRISPR continuar a se desenvolver, incorporar métodos aprimorados como o CRISPR-MIP será crucial para avançar nossa compreensão das funções dos genes e seus papéis em vários processos biológicos. À medida que ganhamos melhores insights, seremos capazes de navegar pelas complexidades das interações gênicas e explorar mais terapias para diferentes doenças.