Novas Descobertas sobre Grânulos de Estresse nas Células

Células eucarióticas, que formam a base de seres vivos complexos como plantas e animais, podem enfrentar vários desafios do ambiente. Esses desafios podem vir de coisas como danos oxidativos, mudanças na concentração de sal, falta de nutrientes, exposição à luz UV e altas temperaturas. Quando as células sentem esses estressores, elas costumam parar de fazer a maioria das Proteínas. Durante esse período, RNAs mensageiros inativos (mRNAs) se reúnem com proteínas e outros componentes celulares para formar estruturas conhecidas como Grânulos de Estresse.

Assim que o estresse é aliviado, esses grânulos de estresse se quebram e os mRNAs voltam ao trabalho de fazer proteínas. Esse ciclo de formação e quebra de grânulos de estresse acontece em todas as células eucarióticas e acredita-se que ajude a proteger as células de danos. Se o processo de formação ou quebra desses grânulos dá errado, pode levar a doenças como neurodegeneração e câncer. Grânulos de estresse também desempenham um papel na maneira como as células combatem vírus, com alguns vírus usando esses grânulos para se espalhar.

#Descoberta dos Grânulos de Estresse

Os grânulos de estresse foram vistos pela primeira vez em células de tomate estressadas por calor usando uma técnica chamada microscopia eletrônica. Após essa descoberta inicial, pesquisadores descobriram que muitos outros tipos de células eucarióticas também podiam formar grânulos de estresse em resposta a vários estressores. A maioria dos estudos sobre grânulos de estresse usou microscopia de luz, muitas vezes rotulando componentes específicos de RNA e proteínas para visualizá-los. Esses estudos sugerem que os grânulos de estresse têm um núcleo denso, com cerca de 150-270 nanômetros de tamanho, cercado por uma camada externa mais solta.

#Desafios na Purificação dos Grânulos de Estresse

O grande tamanho e as propriedades dinâmicas dos grânulos de estresse tornam difícil coletá-los e estudá-los. Pesquisas anteriores muitas vezes usaram um método chamado imunoprecipitação, que depende de anticorpos ligados a proteínas específicas para isolar grânulos de estresse. Esse método tem suas vantagens, como facilidade e variedade de opções de proteínas. No entanto, tem limitações significativas. Por exemplo, a pequena escala das purificações anteriores resultou em quantidades minúsculas de material, limitando a profundidade das análises subsequentes. O uso de muito tampão durante a lise celular também pode destruir as estruturas dos grânulos de estresse e remover componentes essenciais. Além disso, como as proteínas usadas para isolamento podem existir tanto nos grânulos de estresse quanto no citosol, os resultados podem se tornar confusos, misturando componentes de ambos os locais.

Esse estudo introduziu novos métodos para purificar grânulos de estresse de dois organismos modelo: levedura brotadora e células de rim embrionário humano 293T. Esses métodos não dependem de suposições sobre a localização de proteínas específicas, permitindo uma análise mais precisa da composição dos grânulos de estresse.

#Novos Métodos de Purificação

Desenvolvemos um método para isolar núcleos de grânulos de estresse de levedura usando um tratamento que induz estresse oxidativo. Em vez de usar pelotamento seguido de imunoprecipitação, o novo método isola núcleos de grânulos de estresse com base em seu tamanho. O processo começa com uma lise celular suave para manter a integridade das grandes estruturas dos grânulos de estresse. Os pesquisadores coletaram núcleos de grânulos de estresse de frações solúveis, seguindo os marcadores que indicam a formação de grânulos de estresse. Para separar mRNAs traduzindo ativamente dos pools de grânulos de estresse, usamos uma técnica chamada centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Essa abordagem nos permitiu identificar frações de menor densidade enriquecidas com mRNAs, separadas de partículas ribossomais.

Procedimentos semelhantes foram realizados para células de mamíferos. O segredo foi usar as condições corretas e um grande volume de células para garantir material suficiente para uma análise abrangente. As técnicas descritas resultaram efetivamente em grandes núcleos de grânulos de estresse, livres de mRNAs traduzindo.

#Características dos Núcleos dos Grânulos de Estresse

Depois de purificar os núcleos dos grânulos de estresse, examinamos suas propriedades físicas. Na levedura, os núcleos dos grânulos de estresse apresentaram uma distribuição de tamanho estreita, com um tamanho médio de 135 nanômetros. Para células humanas, os núcleos eram um pouco maiores, com cerca de 225 nanômetros. Ambos os tipos foram identificados como partículas distintas, não apenas aglomerados de material.

Para analisar ainda mais os núcleos dos grânulos de estresse, os pesquisadores utilizaram microscopia eletrônica, que mostrou que os núcleos de grânulos de estresse de levedura eram de forma irregular, mas compactos. Ao observar os grânulos de estresse humanos sob condições semelhantes, eles pareciam mais variáveis em tamanho e forma. Em geral, essas observações confirmam que os grânulos de estresse são partículas estruturadas e únicas.

Estudos adicionais revelaram que os núcleos dos grânulos de estresse são relativamente estáveis sob várias condições iônicas, indicando que têm propriedades estruturais específicas. A presença de certos compostos conhecidos por interagir com G-quadruplexos sugeriu que essas estruturas podem desempenhar um papel na formação dos grânulos de estresse.

#Analisando as Proteínas nos Núcleos dos Grânulos de Estresse

Após isolar os núcleos dos grânulos de estresse tanto de leveduras quanto de células humanas, os pesquisadores examinaram seus conteúdos de proteínas. Comparações foram feitas entre as proteínas encontradas nos grânulos recém-purificados e aquelas separadas usando métodos mais antigos. Houve uma sobreposição significativa nas proteínas identificadas, confirmando a presença de componentes conhecidos dos grânulos de estresse, como PABP e vários fatores de iniciação.

Curiosamente, a composição das proteínas nos grânulos purificados variou com base nas condições de crescimento da levedura. Essa descoberta indica que a composição dos grânulos de estresse pode mudar dependendo de vários fatores, incluindo o tipo de estresse e as condições de crescimento das células.

A análise também identificou proteínas associadas a outras funções celulares, incluindo aquelas relacionadas ao citoesqueleto e membranas celulares. Isso sugere que os grânulos de estresse desempenham um papel em vários caminhos dentro das células, não apenas na resposta imediata ao estresse.

#Composição de RNA dos Núcleos dos Grânulos de Estresse

Além de analisar as proteínas, o RNA presente nos núcleos dos grânulos de estresse também foi estudado. A maioria dos RNAs encontrados eram de fato mRNAs, mas o estudo também detectou numerosos RNAs longos não codificantes. Essa descoberta destaca a complexidade da composição de RNA dentro dos grânulos de estresse.

Para os grânulos de estresse de levedura, os mRNAs tinham um comprimento médio de cerca de 1,4 kb, enquanto os mRNAs de células humanas eram em torno de 2,3 kb de comprimento. Esses números estão de acordo com os comprimentos médios de mRNA geralmente vistos tanto em leveduras quanto em células humanas. A análise também sugeriu que mRNAs mais longos podem não ser preferencialmente formados em grânulos de estresse, contradizendo estudos anteriores que propuseram que o comprimento era um fator determinante para a formação de grânulos de estresse.

Os pesquisadores também classificaram mRNAs para entender quais tipos estavam enriquecidos dentro dos núcleos dos grânulos de estresse. Em levedura, certos transcritos relacionados a membranas intracelulares e adaptação ao estresse oxidativo foram encontrados em excesso. Da mesma forma, em células humanas, mRNAs enriquecidos ligados ao processamento de RNA e várias vias celulares foram identificados.

#Heterogeneidade da Composição dos Grânulos de Estresse

Esse estudo destaca que os núcleos dos grânulos de estresse não são entidades uniformes. Medidas físicas sugerem que cada grânulo de estresse contém apenas um pequeno número de mRNAs, levando à conclusão de que diferentes grânulos de estresse podem ter composições de RNA diferentes.

Técnicas de imagem de alta resolução forneceram mais insights, mostrando que enquanto certos mRNAs se localizam dentro dos grânulos de estresse, muitos grânulos não contêm mRNAs específicos. Essa descoberta apoia a ideia de uma composição heterogênea de mRNA dentro de diferentes grânulos de estresse.

#Conclusão

O estudo apresenta novos métodos para purificar núcleos de grânulos de estresse tanto de levedura quanto de células humanas em condições de estresse. Essa abordagem inovadora não depende de suposições anteriores sobre a presença de proteínas específicas, permitindo que os pesquisadores obtenham insights mais profundos sobre a composição e função dessas estruturas celulares importantes.

As descobertas enfatizam a natureza dinâmica dos grânulos de estresse, mostrando que tanto suas composições de proteína quanto de RNA podem variar com base em múltiplos fatores, incluindo tipo de célula, condições de crescimento e a natureza do estresse enfrentado. Esse trabalho estabelece as bases para futuras investigações sobre o papel dos grânulos de estresse nas respostas celulares ao estresse e seu envolvimento em várias doenças.