顕微鏡システムにおける光放出の分析

#顕微鏡モデルとPSF計算

このセクションでは、二重極放射体から発せられる光とそれがナノ粒子とどのように相互作用するかを分析するために使用される顕微鏡システムについて説明するよ。システムは水の中に設置されていて、ガラスカバーグラスの上に置かれ、カバーグラスと顕微鏡の対物レンズの間に油の滴があるんだ。

#a. 顕微鏡システム

顕微鏡システムは点拡がり関数（PSF）を計算するために設計されているよ。ナノ粒子と二重極放射体は水の中でガラスカバーグラスのすぐ上にあるんだ。光学部品はカメラに光を集中させ、このモデルでは一つのレンズとして扱われる。

#b. 数値的アプローチ

PSFを計算するために、三つのステップに従うよ：

1. まず、特殊なソフトウェアを使って、セットアップの上部（水、ガラス、油）の電磁場（EMフィールド）を有限差分時間領域（FDTD）法で計算する。ガラスと油は屈折率が一致しているから、一つの媒体として扱うんだ。
2. 次に、これらの場を遠方半球に投影して、ナノ粒子から1メートル離れたところで光を可視化する。これはソフトウェアの組み込み関数を使って行うよ。
3. 最後のステップでは、これらの場をカメラの平面に集中させてPSFを形成する。

#c. 解析的アプローチ

解析的な方法では六つのステップが含まれるよ：

1. 二重極放射をベクトル球面調和関数の組み合わせで表現して、水中のEM場を計算する。
2. 次に、Mie散乱理論を適用して、発せられた光が球状ナノ粒子によってどのように散乱されるかを決定する。
3. ナノ粒子に対する二重極放射体の位置を考慮して、場を回転させる。
4. 結合された場を平面波に分解する。
5. 水-ガラスの界面で平面波を屈折させる。
6. 最後に、場を遠方に投影してカメラに焦点を合わせる。

#多重散乱

私たちの分析では、ナノ粒子からの多重散乱を無視できるよ。二重極と散乱された場を平面波に分解し、カバーグラスに入る波だけを見てるんだ。

#a. 解析的および数値的PSFの使用

反射成分なしで計算されたPSFと、それを含むPSFを比較するよ。強度の大きな違いは小さく、反射を含めることで増加する複雑さは私たちの最終モデルには必要ないと結論づけるんだ。

#Mie理論と計算時間

無限のMie次数を切り捨ててもPSFに大きな影響を与えないよ。分析によると、場を適切に説明するために必要なのは限られた回数だけなんだ。

#a. Mie次数の切り捨て

切り捨てが結果にどのように影響するかを見るために、ナノ粒子上の二重極のさまざまな構成をテストして、Mie次数が増えるにつれて電場の違いを測定するよ。

#b. 計算時間

PSFを計算するのにかかる時間は、PSFのピクセル数、考慮されるMie次数の数、計算で使用される角度の数の三つの要素に依存するよ。

#数値パラメータの決定

FDTDシミュレーションを実行するとき、正確なPSF結果を得るために、ドメインサイズとメッシュサイズを特定の値に設定するんだ。

#a. シミュレーションサイズとメッシュサイズ

ドメインの幅を変更していくつかのシミュレーションを行い、幅を広くすることでより正確な結果が得られることがわかったよ。細かいメッシュも精度を向上させるけど、その分必要な計算時間も増えるね。

#PSFの完全な比較

異なるナノ粒子構成について、解析的および数値的アプローチからの電気遠方場とPSFを比較するよ。ほとんどの場合、両方の方法からの結果はほぼ同じだってことがわかるんだ。

#歪んだPSFのライブラリ

30分間の測定中に取得した一つのナノ粒子から得られたPSFのコレクションを示すよ。PSFは明確な特徴を示し、時系列順に整理されてるんだ。

#DNA結合イベント

DNA結合が特異的であることを確認するために、相補的でない配列を使ったコントロール実験を行うよ。結合イベントの不在を観察することで、観察されたイベントが特異的相互作用から生じることを確認するんだ。

#異常な形のPSF

ナノ粒子なしでガラス上でDNA-PAINTを行うと、ガウス型のPSFしか見えないんだ。これから、以前言及した独特な形はナノ粒子の存在によるものであることがわかるよ。

#データ分析

生データからPSFを抽出する方法や、背景信号を除去して関連する蛍光信号を分離する方法を詳しく説明するよ。

#a. 例としての時間トレース

時間トレースの例を示して、結合イベントを効果的に表現するために連続フレームを特定してグループ化する方法を解説するよ。

#b. 背景引き算

各イベントについて、背景ノイズから蛍光信号を分離して、結合イベントの正確な分析を可能にするんだ。

#蛍光増強

ナノ粒子上に蛍光物質を置くことで、プラズモニックカップリングによる信号の増加が見られるよ。ナノ粒子上で収集したPSFとそうでないものとの強度の違いを分析するんだ。

#NP位置のグローバルな決定

ナノ粒子の位置を見つける方法を説明し、時間に伴うドリフトに基づいてそれを精緻化するんだ。これにより、各発せられたPSFの正確な測定が確保されるよ。

#PSF形状の曖昧さの解決

複数の発光体位置によって引き起こされるPSFの形状の曖昧さに対処するよ。分析中にナノ粒子の位置を固定することで、さまざまな構成を正確に区別することができるんだ。

#ナノ粒子の実験的特性評価

金ナノ粒子の特性を確認するために、さまざまなイメージング技術を使用して、期待されるサイズと形状に一致することを確かめるよ。

#金ナノ粒子のクラスターからのPSF

ナノ粒子のクラスターから生じるPSFの例を示して、形状と強度における特徴を明らかにするね。

#ローカリゼーションの不確実性

ナノ粒子の表面における位置によって、蛍光物質のローカリゼーション不確実性がどのように変化するかを分析するよ。

#ドッキングストランドのカウントのためのqPAINT

定量的PAINTを使用して、ナノ粒子表面の利用可能なドッキングストランドの数を結合統計を分析して決定するよ。

#自由回転する二重極放射体のPSF

自由に回転する二重極のPSFをサンプリングするとき、それは三つの固定された方向のPSFを平均することによって表されることを示すよ。

#NPサイズとぼかしパラメータの影響

固定されたパラメータがローカリゼーションにどのように影響するかを調べて、いくつかの小さな変動は全体的な結果に大きな影響を与えないと結論づけるんだ。

#蛍光物質の向きに関する他の考慮事項

ナノ粒子の近くにある蛍光物質の異なる向きが、検出されたPSF形状にどのように影響するかを研究するよ。

#収差の特性評価

球面および楕円収差が私たちの測定においてどのように特性評価され、修正されるかを探るよ。

#個々のフレームのPSFフィッティング

結合イベントの個々のフレームからPSFをフィッティングすることがローカリゼーション結果に影響を与えるかどうかを分析して、影響しないと結論づけるんだ。

#視覚的説明の集まり

私たちの方法や発見に関連するさまざまなトピックの視覚的説明を提供して、分析プロセスの明確さを確保するよ。

#解析パラメータの決定

解析モデルに使用されるパラメータは、一貫性を確保するために体系的に定義されるんだ。

#結論

この補足情報は、顕微鏡におけるPSF、ナノ粒子、および関連する現象に関する私たちの作業の方法論、発見、及びその影響を詳しく見せるもので、二重極放射体がナノ粒子に近接して発する光を分析するプロセスを理解するための包括的なリソースとなるよ。