Cupriavidus necatorにおけるDNAデリバリーの向上

大気中の二酸化炭素（CO2）レベルが急上昇してるよ。この増加は環境にとって大きな課題になってる。企業や政府など、いろんなグループがこの問題に対処するための新技術を作ろうとしてるんだ。主な戦略は、二酸化炭素を捕まえて貯蔵する（CCS）ことと、二酸化炭素を有用な製品に変える（CCU）ことだ。CCSはCO2を捕まえて安全に保存することを目的にしてて、CCUはCO2を役立つ製品に変えることに焦点を当ててる。

自然はずっと前からCO2を利用してきたんだ。いろんな微生物がCO2を複雑な有機分子に変えることができる。それによって、これらの小さな生物はCO2レベルを減らすための解決策を開発するのに貴重なんだ。科学者たちは合成生物学のツールを使って、これらの微生物を改造することができる。そうすることで、新しい食品や化学物質などの有用な製品を作れるんだ。でも、ほとんどのツールは、作業が簡単な大腸菌（Escherichia coli）みたいな一般的な細菌向けに設計されてるんだ。

#現在の方法の制限

E. coliやいくつかの酵母はさまざまな化学物質を生産できるけど、CO2を炭素源として利用することはできない。この制約から、異栄養生物（有機化合物を成長に必要とする生物）を合成自生生物（CO2を直接使える生物）に変えることに興味が集まってる。でも、これらの改造された生物の効率と成長速度はしばしば低いんだ。

一方で、自然にCO2を固定できるモデル生物、例えばシネコシスティスやクプリアビダス・ネカトールは、このプロセスに必要な機構を持ってる。だけど、遺伝子的に改造するのは遅くてリソースがかかることが多いんだ。これは、彼らの代謝経路を微調整したり、彼らを使うための適切なプロセスを開発するために、より広範な方法が必要だからだよ。

#クプリアビダス・ネカトール：適切な候補

クプリアビダス・ネカトールH16は、水素を使ってCO2を固定できる最も研究されている細菌の一つだ。いろんな製品を作るために何度も改造されてきた。水素は再生可能エネルギーを使って生成できるから、この細菌はカーボンネガティブプロセスの可能性を提供してるんだ。さらに、C. necatorはCO2から得られるフォルミンを使って成長できる。この特性は、ガス発酵における水素などのガスが液体に溶けにくいという課題を克服するのに役立つんだ。

その可能性にもかかわらず、現代の合成生物学ツールの限られた適用のためにC. necatorを広く使うのはまだ難しい。いろんなプラスミドや遺伝子要素が見つかってるけど、ほとんどのDNA導入方法はE. coliからの接合に頼ってるから、プロセスが手間と時間がかかるんだ。いくつかの研究者はC. necatorにDNAを導入する方法を改善しようとしてるけど、多くの研究はこの目的のために接合に依存してる。

#DNA導入の課題を理解する

C. necatorで作業する上での大きな問題は、制限修飾（RM）システムだ。これらのシステムは細菌に一般的で、外部要素からDNAを保護する役割を果たす。細菌は酵素を使って自分のDNAを修飾し、自分のDNAとウイルスのような侵入者のDNAを区別する手助けをしてる。このシステムは、新しいDNAを細菌に導入しようとする時に課題を生むことがあるんだ。

RMシステムによる制約を克服するために、いくつかの方法が開発されてる：

1. プラスミドの修飾：DNAをRMシステムに「自己」と見なされるように処理することで、制限活性を減らすことができる。

2. プラスミド設計：RMシステムの認識部位が含まれていないプラスミドを設計することで、細菌の防御機構から見えなくする。

3. 一時的な不活化：特定のケースでは、熱処理によって制限酵素を一時的に無効にできる。

4. 制限酵素の削除：いくつかの科学者は、制限酵素を持たない細菌を選んで、株を扱いやすくしている。

これらの方法はすべて、対象生物の遺伝子やメチル化パターンに関する知識が前提になってる。最近では、これらのパターンをより簡単に特定するための新しいアルゴリズムも作成されたよ。

#RMシステムを超えて

研究者たちはRMシステムに焦点を当ててきたけど、他の多くの防御システムも発見してる。一部は外からのDNAをブロックすることができる。これらのシステムはウイルスに対抗することが知られてるけど、一部はプラスミドの変換や安定性にも干渉することがあるんだ。

この研究では、C. necator H16をモデルにして、非モデル細菌へのDNA導入の効率を改善するための計画を提供してる。この計画には、防御システムを調べてDNA導入の効率を高めるためのツールを使うことが含まれてる。

#電気穿孔効率を高める戦略

#ワンポットクローニングと電気穿孔

私たちが開発したアプローチの一つは、メチル化DNAを使ってクローニングと電気穿孔を一度に行う方法だ。この方法は特定の生物に依存しないから、他の非モデル細菌での初期試験を強化できるかもしれない。さらに、C. necator H16の防御機構をバイオインフォマティクスツールを使って調査し、各制限酵素のDNA導入プロセスへの影響を研究するための特別なプラスミドを設計した。

次に、3つの特定のオペロンを削除して、C. necator ΔRMという株を作った。この株はDNA導入効率が改善された。これはC. necator H16をエンジニアリングしやすくするため、他の新しく分離された細菌へのDNA導入の指針を提供することを目指してるんだ。

#電気穿孔の最適化

私たちは小さなプラスミドを使って3つの異なる電気穿孔プロトコルを試して、以前の研究から得られたプロトコルが最も効果的だとわかったよ。このテスト中に、「エスケーパーコロニー」つまりプラスミドなしで成長するコロニーの問題にも気づいた。これを解決するために、抗生物質の濃度を上げたんだ。

テストするプラスミドのサイズを大きくすると、導入効率が大幅に低下して、プロトコルの最適化だけでは解決できない問題があることが分かった。だから、RMシステムがこの低下した効率にどのように影響するかを探ったんだ。

#電気穿孔におけるRMシステムの役割

#メチル化の重要性

C. necatorによってメチル化されたプラスミドと、間違ったメチル化パターンのE. coli由来のプラスミドを比較したんだけど、結果はC. necatorのRMシステムが電気穿孔効率に大きく影響することを確認したよ。正しくメチル化されたプラスミドを使ったとき、変換効率が劇的に改善された。これらの発見は、細菌のパターンに合った天然のメチル化されたプラスミドを使うことが成功の鍵だって示唆してるんだ。

#ゴールデンゲートアセンブリーとメチル化DNA

C. necatorから直接抽出したプラスミドを使うことで、DNA導入率がさらに改善されると仮定した。E. coliの増幅を避けることで、DNAの元のメチル化パターンを保持できるんだ。この目的のためにゴールデンゲートアセンブリー法を使ったけど、これは複数のインサートを簡単にライゲーションでき、PCR増幅を必要としない方法なんだ。

この目的のために新しいプラスミドを作って、C. necator抽出プラスミドをバックボーンとして使うことで、電気穿孔効率が70倍も増加した。私たちのテストでは、一度の電気穿孔で12,000以上のコロニーが生成されたこともあるんだ。

#バイオインフォマティクスと防御システムの分析

RMシステムが電気穿孔を妨げることが確認された後、特定の制限酵素を特定するために取り組んだ。このプロセスは生物のゲノムやメチル化パターンに関する知識を必要とする。REBASEのようなツールや他のバイオインフォマティクスプラットフォームが、C. necator H16内のさまざまな防御システムを特定するのに役立った。

いくつかのメチル化パターンやこれらのシステムの予測機能を見つけたよ。多くは外来DNAをターゲットにすることで知られてるけど、一部はあまり明確に理解されてないものもあった。私たちは、プラスミドの安定性に潜在的に影響を与えるであろうワジェットシステムという防御システムに注目した。

#RMシステムを研究するためのテストプラスミド

各RMシステムの役割を理解するために、特定のテストプラスミドを作成した。一つのプラスミドはタイプIのRMシステムの存在を確認するために設計された。テスト結果は、このシステムの活動による効率の驚くべき損失を示した。

特に、このRMシステムに関連する遺伝子を削除したことは、過去の研究で電気穿孔の成功率を大幅に向上させたことを示してる。これは、C. necatorにおけるプラスミドの取り込みに大きな影響を与えることを意味してるんだ。

#遺伝子修飾とプラスミド安定性

#家庭用株の作成

我々は既存の方法を使って、C. necatorからタイプIとタイプIVのRMシステムを削除して、家庭用株を作った。この削除が電気穿孔効率にどう影響したかを評価した。

結果は、改造がプラスミドの導入効率を改善したことを確認した。特に、RMシステムによって妨げられていたプラスミドにおいて顕著だったんだ。面白いことに、ワジェットシステムの削除は、私たちが行った実験でプラスミドの安定性に顕著な影響を示さなかったよ。

#プラスミド安定性の調査

さらなるテストで、ワジェットシステムがプラスミドの安定性にどう影響するかを見るために不安定なテストプラスミドを作った。期待に反して、行った削除は安定性を大きく変えることはなかった。

#結論

モデル生物からより広範な代替細菌への焦点の移転は、産業バイオテクノロジーに新しい可能性を提供するよ。私たちの研究はC. necator H16に集中し、非モデル細菌へのDNA導入の効率を高める戦略を示してる。

いくつかの研究チームが電気穿孔方法の改善に向けて進展を遂げているけれど、これらの生物の防御システムについての包括的な研究がまだ必要なんだ。これらのシステムを特定し特徴付けることは、成功するエンジニアリングにとって重要だよ。

この研究は、C. necatorでの電気穿孔を改善する方法を示すだけでなく、遺伝子修飾を促進するために細菌の防御機構を理解する重要性を強調してる。そうすることで、急上昇するCO2レベルによって引き起こされる緊急の環境問題に対処するために、これらの微生物のユニークな能力を利用できるようになるんだ。