細胞フリータンパク質合成の進展

無細胞タンパク質合成（CFPS）は、科学者が生きた細胞を使わずにタンパク質を生産する方法だよ。DNAをテンプレートにしてmRNAを作って、それがタンパク質形成に繋がる自然な転写と翻訳のプロセスに依存してる。これが制御された環境で行われるから、研究者は基本的な生物学的メカニズムを調べたり、合成生物学やバイオテクノロジーの様々な応用を探ったりできるんだ。

CFPSは年月が経つにつれて、バイオ製造、診断、バイオセンサーなど様々な分野に応用されてきたよ。実用的な使い方に加えて、基本的な研究のプラットフォームとしても活用されていて、科学者は生きた細胞の特定の側面を模倣するバイオ分子システムを設計できるんだ。

#CFPS反応の構成要素

CFPS反応は主に3つの要素で構成されているよ：

1. DNAテンプレート： 特定のタンパク質を作るために必要な遺伝子情報を含むDNAの部分。

2. 小分子基質： RNAを構築するためのヌクレオチド三リン酸（NTP）、タンパク質合成に必要なアミノ酸、遺伝コードをタンパク質に翻訳するのを助ける転移RNA（tRNA）が含まれる。

3. 分子機械： タンパク質合成を行うために協力する酵素、翻訳因子、リボソームなどが含まれる。

この分子機械は様々なソースから来ることができて、細胞から抽出されたもの（明瞭細胞溶解物と呼ばれる）か、PURE（再組換え要素を用いたタンパク質合成）という方法で生成されたものなんだ。PUREシステムは精製されたリボソームや必要なタンパク質因子を含んでいて、効率的にタンパク質合成に必要なタスクを実行できるようになってる。

#PUREシステム

PUREシステムは、研究者にCFPSのためのより制御された環境を提供するために導入されたもので、E. coliからタンパク質合成に必要なすべての要素を精製された形で含むように開発されたんだ。これにより、細胞溶解物に存在する多くの変数を排除できて、より正確な実験が可能になるんだ。

PUREシステムを使うことで、研究者は変わったアミノ酸をタンパク質に組み込んだり、タンパク質がin vitroで進化する様子を研究したりするなど、多くの異なる道を探ることができるよ。ただ、強みがある一方で、特定の時間内に作れるタンパク質の量や反応の全体寿命に関して制限もあるんだ。

#無細胞タンパク質合成の課題

PUREシステムには多くの利点があるけど、いくつかの課題にも直面してるよ：

1. 低生産量： 生産されるタンパク質の量はしばしばあまり高くないんだ。例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）が1ミリリットルあたり約200マイクログラムしか作れないことがある。

2. 短い寿命： 反応は約1時間しか活性を維持できないよ。

これらの制限は、翻訳の速度が遅かったり、タンパク質の折りたたみに問題があったり、tRNAや翻訳因子のような重要な成分が減ってしまったりすることから生じるんだ。さらに、不要な副産物が蓄積することで、プロセスがさらに妨げられることもあるよ。

#溶解物ベースのシステムにおける歴史的改善

CFPSの大部分の基盤は、より広範に研究されてきた溶解物ベースのシステムで築かれたんだ。初期の研究では、E. coliの溶解物の性能を向上させてバッチ反応でのタンパク質生産を強化することに焦点が当てられてた。発見された一つの重要な制限は、ATPの分解によって生じる無機リン酸の蓄積だった。この蓄積は、合成プロセスに関わる多くの酵素に必要なマグネシウムイオンのレベルを低下させ、生産性が低下する原因となってたんだ。

CFPSはエネルギーを多く消費するから、効果的に機能を続けるためには生化学的エネルギーの一貫した補充が必要なんだ。単純なエネルギー再生戦略が利用されてたけど、これらはしばしばリン酸の一方向の移動をもたらし、不要な副産物がさらに蓄積することになってた。

#課題克服への戦略

リン酸の蓄積とエネルギーの枯渇の問題を解決するために、研究者たちは主に2つの戦略を探求してるよ：

1. リン酸の物理的除去： これは、連続交換やフローレクターのような方法を通じて、システムをスムーズに動かすことができる。

2. 生化学的リサイクル： これは、リン酸をリサイクルできるシステムを工学的に設計する方法だよ。この例として、研究者たちがE. coliの溶解物にピルビン酸オキシダーゼを加えたケースがある。これは、ピルビン酸と無機リン酸をアセチルリン酸に変換するのを助け、その後ATPの再生に使われる。

こういった技術を用いることで、4 mg/mlまでのタンパク質生産量を達成し、反応の寿命も延びたよ。

#PUREシステムの改善

ただ、PUREシステムは通常、クリエチンリン酸/クリエチンキナーゼ（CP/CK）エネルギー再生セットアップに依存していて、同じリン酸の蓄積問題を引き起こす可能性があるんだ。だから、研究者たちは、溶解物システムで使われているリン酸リサイクル法をPUREアプローチに実装すれば、全体的な性能を改善できるんじゃないかと仮定したの。

#ピルビン酸-アセテート経路（PAP）

この新しい戦略では、3つの酵素が生産されてPUREシステムに追加され、ピルビン酸-アセテート経路（PAP）と呼ばれるものが作られた。これは、ピルビン酸オキシダーゼ、アセテートキナーゼ、カタラーゼを統合して、リン酸をリサイクルしながらATPを効率的に再生する。

目標は、この新しいエネルギー再生経路がPUREシステムにおける生産量と寿命の制限に直接対処できるかどうかを確認することだったんだ。

1. 酵素の生産： 研究者たちはPAPに必要な3つの酵素を生産し、精製した。最初にE. coliで生産されたピルビン酸オキシダーゼ酵素は不溶性のタンパク質を形成してたけど、発現条件を調整することで、いくつかの酵素を可溶性の形で得られるようになったよ。

2. 条件の最適化： 研究者たちは、新しい経路が効率的に機能するようにCFPS反応を効果的に設定する方法をテストした。初期実験では、カリウムリン酸のような特定の成分を加えることでタンパク質出力が大幅に増加し、他の形態では抑制が起こった。

3. 酵素活性の重要性： テストで、3つの酵素すべてが成功したタンパク質合成にとって重要であることが確認された。例えば、カタラーゼを外すと、酸化ダメージのために得られるタンパク質の生産量が大幅に減少した。

#新しい経路からの結果

PAPのセットアップは期待が持てて、4時間で約72マイクログラムの蛍光タンパク質mCherryを生産したんだ。これでも最初のCP/CKシステム単独での出力よりは低いけど、両方の方法を組み合わせることで、合計タンパク質生産量は230マイクログラムのmCherryに達する素晴らしい増加を示した。

この組み合わせは出力を増加させただけでなく、タンパク質合成の速度も改善されて、経路が相互に悪影響を与えることなく働けることを示してるよ。

#ラグタイムと反応寿命

タンパク質生産量を調べるだけでなく、研究者たちはこれらの新しい条件下での反応の動力学も調べたんだ。ラグタイムは、合成開始から最初に検出可能な量のタンパク質が存在するまでの時間と定義される。

彼らは、PAPによって駆動された反応がCP/CKによって駆動された反応に比べてラグタイムが増加していることを発見した。この遅延は、ピルビン酸オキシダーゼ反応が酸素に依存しているため、全体のタンパク質生産の速度が制限されることに起因している場合があるよ。

#商業システムでの応用

PAPがPUREシステムに統合された成功に勇気づけられた研究者たちは、これらの発見がPURExpressシステムのような商業セットアップでも再現できるかどうかを探ったんだ。彼らは、PAPの成分を使用することで、CP/CKシステム単独と比較してタンパク質合成の生産量が大幅に改善されることを発見したよ。

自社のPURE実験と同様に、商業環境で両方のシステムを組み合わせることで、mCherryの350マイクログラムを超えるさらなる高いタンパク質生産量が確認され、PAP経路の統合が様々なCFPSシステムに適用可能であることが示された。

#結論

結論として、この研究は、PUREシステムに別のエネルギー再生経路を導入することで、タンパク質生産を大幅に向上できることを示したよ。ピルビン酸-アセテート経路を活用することで、科学者はより高い生産量と長い反応寿命を達成できるようになった。このシステム設計の柔軟性は、今後の無細胞タンパク質合成や合成生物システムの発展への道を切り開くんだ。

結果は、タンパク質合成システムに並行する代謝経路を統合することが実現可能であるだけでなく、生産性の大幅な向上にも繋がることを示していて、バイオテクノロジーや合成生物学の様々な分野で研究者にとって貴重なツールになるんだ。