Usare FlyVISTA per studiare il sonno nelle mosche della frutta

Il cervello ha il compito importante di raccogliere informazioni sia dal corpo che dal mondo esterno per aiutarci ad agire in modo appropriato. I ricercatori studiano come si comportano gli animali per scoprire di più su questo processo. Nuove tecnologie, specialmente nei computer e nell'apprendimento automatico, hanno creato un nuovo campo chiamato etologia computazionale. Questo campo si concentra sulla misurazione automatica di diversi aspetti del comportamento animale. La maggior parte di questi studi ha esaminato movimenti più grandi in brevi periodi di tempo.

Da oltre 150 anni, scienziati come Darwin e Tinbergen hanno fatto notare che anche piccoli movimenti delle parti del corpo o cambiamenti nella postura possono segnalare sentimenti importanti come paura o ansia, specialmente in animali come gatti e gabbiani. Questi piccoli movimenti, noti come "microcomportamenti", sono molto importanti ma difficili da studiare. La sfida nasce dalla difficoltà di rilevare accuratamente questi piccoli movimenti e analizzare immagini di alta qualità per lunghi periodi.

Per affrontare questo problema, abbiamo creato FlyVISTA, un sistema che utilizza l'apprendimento automatico per descrivere e misurare questi microcomportamenti nelle mosche della frutta, in particolare Drosophila. Questo sistema utilizza video ad alta definizione per tenere traccia delle mosche, permettendo anche ai ricercatori di introdurre cambiamenti nel loro ambiente utilizzando laser ad infrarossi. FlyVISTA impiega un modello di apprendimento automatico per etichettare 35 differenti parti del corpo delle mosche. Dopo l'etichettatura, estrae comportamenti significativi da queste etichette nel tempo.

Abbiamo usato FlyVISTA per studiare il sonno nelle mosche della frutta. Il sonno è un comportamento fondamentale presente in molte specie, ma il suo scopo non è ancora del tutto noto. La maggior parte della ricerca sul sonno si è concentrata sui mammiferi, ma studiare il sonno in organismi più semplici come le mosche della frutta può fornire intuizioni preziose. Analizzare il sonno delle mosche della frutta può aiutarci a capire di più sulle funzioni essenziali del sonno e su come si sia evoluto.

Tradizionalmente, i ricercatori hanno esaminato il sonno nelle mosche della frutta controllando i periodi di inattività che durano più di cinque minuti in un piccolo tubo. Tuttavia, questo metodo ha i suoi difetti. Potrebbe perdere movimenti brevi o piccoli comportamenti che fanno parte del sonno. Inoltre, tenere le mosche in tubi stretti può causare stress e influenzare il loro comportamento naturale. Quindi, abbiamo cercato di sviluppare un sistema che fornisca una visione più accurata del comportamento di sonno nelle mosche della frutta che si muovono liberamente.

Il sonno è generalmente considerato uno stato tranquillo. Durante il sonno si possono osservare diversi microcomportamenti. Ad esempio, nei mammiferi, la mancanza di movimento o alcuni rapidi movimenti oculari possono indicare un sonno più profondo o una fase specifica del sonno. Studi precedenti su api e scarafaggi hanno mostrato movimenti simili legati al sonno.

Con FlyVISTA, abbiamo trovato una varietà di microcomportamenti durante il sonno nelle mosche della frutta, tra cui il rilassamento della postura del corpo, le antenne che si abbassano e movimenti ritmici della proboscide. Abbiamo anche testato come l'attivazione di due circuiti neurali specifici coinvolti nella promozione del sonno influisca sui microcomportamenti. Un circuito neurale, chiamato neuroni dFB, era collegato ad un aumento dei piccoli movimenti piuttosto che al sonno, mentre un altro, chiamato neuroni R5, promuoveva estensioni della proboscide seguite da sonno prolungato.

È interessante notare che abbiamo identificato un nuovo microcomportamento chiamato "commutazione delle haltere", che si riferisce a un movimento specifico delle haltere. Le haltere sono piccoli organi nelle mosche che fungono in modo simile al sistema vestibolare, che aiuta nell'equilibrio nei mammiferi. Questo movimento di commutazione è stato osservato solo durante i momenti di calma e sembrava segnare un livello più profondo di sonno.

#Imaging Video ad Alta Risoluzione

Per studiare meglio questi comportamenti, abbiamo progettato un sistema che consente alle mosche di muoversi liberamente e di essere registrate in alta definizione. Nella nostra camera, abbiamo utilizzato una vista laterale per catturare più comportamenti, poiché la ricerca su altri insetti ha mostrato che cambiamenti importanti, come le antenne abbassate, sono meglio visibili di lato. Questo setup ci ha permesso di vedere la mosca in modo molto più dettagliato rispetto ad altri metodi.

Per tenere traccia dei movimenti della mosca, abbiamo usato DeepLabCut, uno strumento software che aiuta a etichettare e analizzare le parti del corpo utilizzando un modello addestrato. Con questo strumento, abbiamo tracciato 35 punti sul corpo della mosca. Queste informazioni ci aiutano a capire come si muovono le diverse parti del corpo in relazione tra loro nel tempo.

Abbiamo registrato singole mosche per lunghi periodi e esaminato la loro attività. Come previsto, abbiamo notato picchi di movimento in determinati momenti della giornata. Di notte, le mosche mostrano lunghi periodi di inattività, che abbiamo collegato al sonno.

Durante questi periodi di quiete, abbiamo identificato vari microcomportamenti. Dopo essere diventata immobile, la postura del corpo di una mosca si rilassava sotto la gravità. Le antenne si abbassavano e sono stati osservati anche movimenti ritmici della proboscide. Questi movimenti non erano esclusivi del sonno, poiché si osservavano anche quando le mosche si pulivano o si alimentavano.

Inoltre, il comportamento di commutazione delle haltere, che coinvolge un movimento verso il basso delle haltere, è stato osservato costantemente durante i momenti di calma. Questo particolare comportamento non è stato notato in studi precedenti e illustra la varietà di microcomportamenti presenti durante il sonno.

#Valutazione delle Soglie di Arousal

Un aspetto cruciale per definire il sonno è l'idea di una soglia di arousal aumentata. Per testare questo, abbiamo usato un laser infrarosso speciale che le mosche non possono vedere. Riscaldando gradualmente le mosche dopo che erano state inattive per un po’, abbiamo misurato quanta energia era necessaria per farle muovere di nuovo. La risposta di ogni mosca era unica, quindi abbiamo standardizzato le misurazioni per il confronto.

Come previsto, abbiamo scoperto che la quantità di energia necessaria per disturbare le mosche variava durante la notte. La soglia era bassa in determinati momenti e molto più alta in altri periodi, suggerendo cambiamenti dinamici nella profondità del sonno nel corso della notte.

La maggior parte degli studi ha definito il sonno come periodi di inattività superiori a cinque minuti. Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che periodi di inattività più brevi di tre minuti sono più significativi e dovrebbero essere considerati come indicativi del sonno. Le mosche sono state viste rimanere vicino al loro cibo durante questi momenti di calma, indicando che potrebbero prepararsi per Dormire nelle vicinanze.

Dal momento che il nostro sistema è preciso e non comporta lo spostamento delle mosche, abbiamo potuto osservare come i loro microcomportamenti cambiassero mentre si svegliavano. Abbiamo notato che certi movimenti delle haltere e delle antenne si verificavano spesso appena prima che le mosche tornassero attive, suggerendo un collegamento tra questi piccoli movimenti e la transizione dal sonno alla veglia.

#Attivazione dei Circuiti Neurali e Analisi Comportamentale

Per studiare ulteriormente i comportamenti di sonno, abbiamo manipolato due circuiti neurali noti per influenzare il sonno nelle mosche della frutta. Un gruppo di neuroni è stato collegato all'induzione rapida di stati simili al sonno, mentre un altro gruppo è connesso al bisogno generale di sonno.

Quando abbiamo attivato il primo gruppo di neuroni, abbiamo notato una diminuzione dei movimenti ma non un vero sonno. Invece, abbiamo osservato che le mosche mostrano più micro-movimenti e comportamenti di pulizia, indicando che l'attivazione di questi neuroni non promuove il sonno.

Tuttavia, l'attivazione dell'altro gruppo di neuroni ha portato a un aumento dei movimenti di probing della proboscide durante la stimolazione, seguiti da sonno duraturo. Questa risposta indica che questi neuroni possono svolgere un ruolo cruciale nel bisogno di sonno e nei processi fisiologici a esso connessi.

Il nostro studio con FlyVISTA ci ha permesso di classificare diversi comportamenti prima, durante e dopo queste attivazioni neurali. I risultati hanno mostrato comportamenti distinti legati all'attivazione dei diversi circuiti. Le mosche i cui neuroni dFB sono stati attivati non sono entrate in uno stato di sonno nonostante il loro movimento ridotto, mentre l'attivazione dei neuroni R5 ha portato a estensioni della proboscide aumentate e a uno stato di sonno successivo.

#Riconoscimento Automatico del Comportamento

Uno degli obiettivi principali nello studio del comportamento animale è misurarlo automaticamente. Anche se strumenti come DeepLabCut hanno reso più facile etichettare i movimenti, estrarre comportamenti significativi da queste etichette rimane una sfida, specialmente per i microcomportamenti sottili legati al sonno.

Per affrontare questo, abbiamo sviluppato un sistema all'interno di FlyVISTA che classifica i comportamenti da dati video non annotati basandosi su un insieme di esempi manualmente annotati. Il sistema assegna etichette a cinque categorie comportamentali in base ai movimenti osservati delle mosche. Tuttavia, a causa della loro natura sottile e variata, classificare alcuni comportamenti si è dimostrato più difficile di altri.

Attraverso il nostro nuovo pipeline computazionale, siamo riusciti a distinguere i comportamenti delle mosche con un relativo successo. Ad esempio, il nostro sistema ha identificato con precisione i comportamenti di estensione della proboscide e di alimentazione più di altri. Tuttavia, abbiamo scoperto che il comportamento riguardante i movimenti delle haltere era più difficile da tracciare in modo affidabile a causa della loro sottigliezza e della difficoltà di osservarli costantemente.

#Misurare il Sonno con FlyVISTA

Utilizzando FlyVISTA, abbiamo quantificato il sonno nelle mosche della frutta basandoci sui nostri criteri di osservare periodi di inattività che durano oltre tre minuti, escludendo pulizia e alimentazione. I nostri risultati hanno mostrato che i modelli di sonno nelle mosche che si muovono liberamente sono più consolidati rispetto a quanto riportato in precedenti studi su mosche legate.

Abbiamo analizzato quantità e durate del sonno durante periodi specifici della giornata. Le mosche femmina generalmente mantenevano livelli di sonno più elevati durante la notte, mentre le mosche maschio mostrano una significativa diminuzione del sonno verso le ore notturne successive.

Per confrontare i nostri risultati con le approcci tradizionali, abbiamo utilizzato un altro metodo per misurare il sonno in tubi piccoli. Abbiamo trovato che la quantità di sonno rilevata utilizzando metodi convenzionali era superiore a quella osservata con FlyVISTA. Utilizzando FlyVISTA, abbiamo portato a una gamma più ristretta di durata del sonno, indicando che le mosche probabilmente hanno una lunghezza standard per i periodi di sonno.

Dopo aver privato meccanicamente le mosche del sonno, abbiamo osservato un aumento della durata e delle quantità di sonno sia nelle mosche maschio che femmina, confermando che il nostro approccio utilizzando FlyVISTA è efficace nel misurare il comportamento del sonno.

#Comportamento di Estensione della Proboscide nelle Mosche della Frutta

Abbiamo anche indagato come i microcomportamenti delle mosche della frutta, specificamente le estensioni della proboscide, cambiano nel tempo e in condizioni diverse. In circostanze normali, la frequenza delle estensioni della proboscide rimane costante durante la notte, senza mostrare una chiara diminuzione come era stato riportato in precedenza.

È interessante notare che queste estensioni si verificano principalmente durante il sonno, suggerendo una forte connessione tra questo comportamento e gli stati di sonno. Dopo la privazione del sonno, si è notato un aumento significativo delle estensioni della proboscide, indicando un controllo omeostatico.

Questa relazione fornisce intuizioni su come tali comportamenti possano essere regolati in modo diverso in varie condizioni. Sottolinea l'importanza di studiare questi microcomportamenti per comprendere appieno l'architettura del sonno nelle mosche della frutta.

#Comportamento di Commutazione delle Haltere: Una Nuova Intuizione

Infine, ci siamo concentrati sul comportamento di commutazione delle haltere, che mostra promesse nel definire stati di sonno più profondo nelle mosche. Le evidenze suggeriscono che questi movimenti delle haltere sono strettamente legati al sonno, verificandosi quasi interamente durante i periodi di sonno.

Abbiamo scoperto che la prima occorrenza delle commutazioni delle haltere di solito avviene poco dopo l'inizio del sonno, indicando che questo comportamento può segnalare una transizione verso un sonno più profondo rapidamente. Inoltre, abbiamo scoperto che quando le haltere erano nella posizione "giù", le mosche avevano una soglia di arousal più alta, suggerendo che queste commutazioni indicano uno stato di sonno più profondo.

Inoltre, abbiamo notato vari tipi di movimenti delle haltere, tra cui oscillazioni ritmiche che erano spesso accompagnate da altri movimenti sottili nel corpo della mosca. Questi movimenti ritmici fanno pensare che ci potrebbero essere diverse fasi del sonno che necessitano di ulteriore esplorazione.

#Conclusione

In sintesi, l'uso di FlyVISTA ha aperto nuove strade per studiare il sonno e il comportamento nelle mosche della frutta. Combinando imaging ad alta risoluzione e algoritmi avanzati, possiamo comprendere meglio la complessità del sonno e identificare comportamenti sottili che in precedenza erano stati trascurati.

I nostri risultati sui microcomportamenti legati al sonno, il ruolo dei diversi circuiti neurali e la dinamica del sonno utilizzando FlyVISTA forniscono intuizioni significative sulla natura del sonno nelle mosche della frutta. Man mano che continuiamo a perfezionare le nostre tecniche e metodi di analisi, scopriremo ancora di più sulle intricate relazioni tra comportamento, sonno e i meccanismi neurali sottostanti. Questo lavoro non solo migliora la nostra comprensione del comportamento delle mosche della frutta, ma contribuisce anche a discussioni più ampie sul sonno e sul comportamento tra le specie.