Rilevare segnali di calcio nei neuroni usando l'apprendimento PU

L'imaging degli Ioni di Calcio (Ca2+) è una tecnica usata per studiare come le cellule nel cervello cambiano la loro attività. Questo metodo permette agli scienziati di osservare e analizzare da vicino come funzionano i processi cerebrali, da grandi gruppi di neuroni a piccole connessioni tra di loro. Usando strumenti di imaging speciali e sensori fluorescenti, i ricercatori possono vedere come i livelli di Ca2+ variano in diverse parti del neurone.

Negli ultimi anni, i miglioramenti nei sensori fluorescenti hanno reso più facile osservare questi cambiamenti in piccole aree di cellule come le sinapsi. Per esempio, i ricercatori hanno studiato piccoli picchi di segnali di calcio noti come Miniature Synaptic Calcium Transients (mSCTs). Questi picchi si verificano quando sostanze chimiche vengono rilasciate dai neuroni e causano un flusso di calcio nelle cellule. Studiare questi eventi è importante perché offrono spunti su come comunicano i neuroni.

Tuttavia, analizzare questi segnali di calcio non è semplice. Gli mSCTs possono avere forme e dimensioni diverse e spesso presentano piccole variazioni di luminosità, rendendo difficile automatizzare il processo di rilevamento. I metodi tradizionali che cercano specifici livelli di luminosità per identificare questi segnali potrebbero non funzionare bene, specialmente quando i segnali cambiano in dimensione o forma col tempo.

Per affrontare queste sfide, i ricercatori hanno iniziato a usare metodi più avanzati che tengono conto della variabilità di questi segnali di calcio. Alcune di queste tecniche includono l'uso di soglie di rumore per migliorare il rilevamento e l'applicazione del machine learning per analizzare automaticamente i dati. Il Deep Learning, un tipo di machine learning avanzato, ha mostrato promettenti risultati nel rilevare e analizzare questi eventi di calcio.

Nonostante questi progressi, sviluppare modelli di deep learning per analizzare l'imaging del calcio richiede un sacco di dati etichettati. Tuttavia, molte volte ci sono più immagini senza eventi di calcio, il che aumenta la complessità. Una soluzione a questo problema si chiama Positive Unlabeled (PU) learning, dove gli scienziati possono sfruttare sia dati etichettati che non etichettati per migliorare i loro modelli.

In questo articolo, proponiamo un nuovo metodo usando il PU learning per rilevare gli mSCTs in cellule cerebrali coltivate. Questo approccio consente l'identificazione e la Segmentazione automatica di questi segnali di calcio, anche quando hanno forme e intensità variabili.

#Metodi

#Coltura di cellule neurali

Per preparare le cellule cerebrali per lo studio, abbiamo usato cellule di ratti giovani. Le cellule sono state separate dal loro tessuto originale e cresciute su superfici speciali che aiutano a farle aderire. Hanno ricevuto una soluzione nutritiva che le mantiene in salute. Per fermare la crescita di altri tipi di cellule, ogni settimana è stata aggiunta una sostanza chimica alla soluzione.

Per i nostri studi di imaging, abbiamo introdotto una proteina speciale che si illumina quando è presente il calcio. Questa proteina ci aiuta a vedere quando e dove si verificano cambiamenti di calcio nei neuroni.

#Soluzioni di imaging e farmacologia

Quando studiavamo i neuroni, abbiamo usato una soluzione speciale per mantenere le cellule nell'ambiente giusto. Inizialmente, abbiamo incluso calcio e magnesio nella soluzione, ma successivamente l'abbiamo cambiata per rimuovere il magnesio e aggiungere TTX, una sostanza che blocca i segnali dai neuroni. Questa modifica ha aiutato a osservare i segnali di calcio più chiaramente. Per stimolare cambiamenti nei neuroni, abbiamo usato una soluzione che incoraggiava l'attività del calcio.

#Imaging dal vivo

Usando un microscopio potente, abbiamo catturato immagini dei neuroni in azione. L'impostazione ci ha permesso di concentrarci su dettagli specifici nei dendriti, le parti del neurone che ricevono segnali. Abbiamo registrato video degli eventi di calcio che si verificavano nel tempo. L'imaging è stato fatto ad alta frequenza per catturare cambiamenti rapidi.

Per studiare come i segnali di calcio cambiassero dopo una specifica stimolazione, abbiamo eseguito una registrazione di base prima di applicare la stimolazione e poi registrato di nuovo dopo.

#Rilevamento e analisi dei segnali di calcio

Per rilevare e analizzare gli mSCTs, abbiamo sviluppato un metodo basato su soglie di intensità. Questa tecnica prevedeva di esaminare la luminosità dei segnali nel tempo per identificare eventi di interesse. Inizialmente, abbiamo completato una correzione del rumore di fondo per migliorare la chiarezza.

Il processo di rilevamento prevedeva l'uso di due soglie: una per identificare potenziali mSCTs e un'altra per segmentarli accuratamente. Dopo il rilevamento automatico, esperti hanno revisionato i risultati per assicurare l'accuratezza.

#Dataset di addestramento per il deep learning

Abbiamo creato un dataset di addestramento usando un certo numero di video con eventi di calcio identificati manualmente. Questo dataset includeva sia esempi positivi (dove erano presenti mSCTs) che esempi non etichettati (regioni senza segnali di calcio).

I dati non etichettati sono diventati importanti mentre addestravamo i nostri modelli di deep learning a riconoscere schemi e ridurre i falsi positivi.

#Modelli di deep learning

Abbiamo usato due diversi modelli di deep learning, 3D U-Net e StarDist-3D, che sono efficaci nell'analizzare dati di imaging. Entrambi i modelli sono stati addestrati per migliorare il rilevamento e la segmentazione basati sui dati etichettati e non etichettati che abbiamo preparato.

Il processo di addestramento prevedeva l'aggiustamento dei modelli per differenziare accuratamente tra eventi reali di calcio e rumore di fondo. Nel corso di diverse iterazioni, abbiamo valutato quanto bene questi modelli performassero nel rilevare mSCTs a vari livelli di luminosità.

#Valutazione delle prestazioni del modello

Per valutare come stavano andando i nostri modelli, abbiamo usato metriche come precisione e richiamo, che misurano quanti degli eventi rilevati erano corretti. Inoltre, abbiamo valutato come i modelli performassero in base alla luminosità degli eventi di calcio per capire dove avessero difficoltà.

#Analisi multidimensionale

Il nostro approccio ci ha permesso di estrarre caratteristiche e caratteristiche degli mSCTs rilevati, come la loro forma, dimensione e comportamento temporale. Usando algoritmi di clustering, abbiamo classificato gli mSCTs in sottotipi basati su queste caratteristiche.

Abbiamo anche guardato a come l'applicazione della nostra stimolazione influenzasse la presenza e le caratteristiche degli mSCTs. Confrontando diversi punti temporali, potevamo analizzare come i neuroni si adattassero agli stimoli.

#Risultati

#Rilevamento degli mSCTs

Usando il nostro metodo, siamo riusciti a rilevare con precisione gli mSCTs nelle immagini neuronali. L'applicazione del PU learning ha migliorato i tassi di rilevamento, specialmente per i segnali di calcio deboli. I modelli hanno performato bene a diversi livelli di luminosità, il che significa che potevamo catturare sia segnali forti che deboli in modo efficace.

#Prestazioni di segmentazione

Abbiamo anche ottenuto buoni risultati di segmentazione, il che significa che siamo riusciti a delineare accuratamente le aree dove si sono verificati gli eventi di calcio. I modelli di deep learning hanno mostrato una migliore correlazione con le annotazioni degli esperti rispetto ai metodi precedenti. Questo significa che i nostri metodi sono affidabili per identificare e analizzare gli mSCTs.

#Analisi dei cambiamenti dopo la stimolazione

Dopo l'applicazione della stimolazione, abbiamo osservato un aumento del numero di mSCTs rilevati. Abbiamo scoperto che le caratteristiche di questi eventi cambiavano dopo la stimolazione. Più specificamente, alcuni sottotipi di mSCTs sono diventati più prevalenti.

#Classificazione basata su caratteristiche

Abbiamo classificato gli mSCTs rilevati in diverse categorie basate sulle loro caratteristiche. Utilizzando classificatori ad albero decisionale, abbiamo rivelato quali caratteristiche erano più importanti per prevedere i tipi di eventi. Questa classificazione ha fornito spunti su come gli eventi di calcio rispondessero alla stimolazione e la loro relazione con l'attività neuronale.

#Discussione

Il nostro studio evidenzia il potenziale dell'uso del PU learning nel campo dell'imaging del calcio. Sfruttando sia dati etichettati che non etichettati, abbiamo migliorato la nostra capacità di rilevare e comprendere segnali di calcio a bassa intensità nei neuroni. Questo ha importanti implicazioni per lo studio della dinamica neuronale e della plasticità.

Il metodo che abbiamo presentato è probabilmente applicabile ad altri dataset dove gli eventi di calcio possono essere scarsi o indistinti. Le intuizioni ottenute dalla nostra analisi potrebbero aiutare ad approfondire la nostra comprensione dei comportamenti neuronali e delle risposte a diversi stimoli.

Man mano che la ricerca sul cervello continua a svilupparsi, strumenti come il PU learning possono fornire preziose intuizioni sui meccanismi cellulari in gioco. Rilevando e analizzando con precisione i segnali di calcio, possiamo approfondire la nostra comprensione di processi critici coinvolti nell'apprendimento, nella memoria e in altri comportamenti complessi nel cervello.

In conclusione, l'integrazione di tecniche di rilevamento avanzate e modelli di deep learning presenta una nuova frontiera nello studio dell'attività cerebrale. I nostri risultati enfatizzano l'importanza di un rilevamento e di una segmentazione accurati degli eventi di calcio, aprendo la strada per future ricerche in neuroscienze.