Progressi nelle tecniche di espressione delle proteine

Le proteine sono parti essenziali di tutti gli organismi viventi. Giocano ruoli chiave in tanti processi biologici. Capire come funzionano e interagiscono tra di loro è importante per molte aree della scienza, tra cui medicina e genetica. Un aspetto interessante delle proteine è che possono formare complessi con altre proteine. Questo è particolarmente importante per capire come funzionano e come si sono evolute nel tempo.

Nelle cellule, spesso è necessario studiare le azioni e le interazioni di più geni contemporaneamente. Negli organismi più semplici come batteri e lieviti, gli scienziati possono facilmente esprimere molti geni usando sequenze di DNA specifiche chiamate promotori. Tuttavia, questo può essere complicato negli organismi più complessi. Negli animali, ottenere che più geni lavorino insieme può essere piuttosto difficile.

#Tecniche di Espressione Genica

Un modo per esprimere più geni contemporaneamente è usare un tipo speciale di RNA messaggero (mRNA). Questo tipo di mRNA può trasportare le informazioni per diversi geni. Ad esempio, una sequenza chiamata Internal Ribosome Entry Site (IRES) permette la traduzione di due geni da un'unica catena di mRNA. Tuttavia, usare l'IRES spesso porta a una produzione inferiore del secondo gene rispetto al primo.

Un altro metodo avanzato coinvolge l'uso di peptidi corti noti come peptidi 2A. Questi peptidi aiutano a esprimere più proteine da una sola catena di mRNA. Quando questi peptidi vengono prodotti, interferiscono con il ribosoma in un modo che permette al sistema di saltare certe sezioni, portando alla produzione di diverse proteine. Questo metodo ha dimostrato di funzionare per esprimere fino a quattro geni contemporaneamente, ma l'efficienza diminuisce per ogni gene aggiuntivo.

Nelle cellule dei mammiferi, un sistema chiamato MultiLabel può esprimere fino a cinque geni alla volta. Questo sistema è basato su un metodo di espressione del baculovirus usato in particolari linee cellulari di falena.

#Splicing Alternativo

Un altro modo in cui la natura crea diversità nelle proteine è attraverso un processo chiamato splicing alternativo. Questo permette a un singolo gene di produrre più forme proteiche includendo o escludendo certi segmenti durante la creazione di mRNA. Un esempio ben noto di splicing alternativo è la molecola di adesione cellulare per la sindrome di Down della Drosophila, o DSCAM. Il gene Dscam può formare molte versioni diverse della proteina grazie al suo complesso meccanismo di splicing.

Il Dscam contiene un insieme di esoni che possono essere selezionati in modo mutuamente esclusivo. Questo significa che durante il processo di trascrizione, solo una versione tra diverse opzioni viene inclusa nell'mRNA finale. Questo crea una vasta varietà di potenziali prodotti proteici.

#Il Sistema di Espressione Poly-Transgene (PXGS)

Il Sistema di Espressione Poly-Transgene (PXGS) è un nuovo metodo che utilizza la proprietà di splicing alternativo del Dscam. Inserendo l'intera regione di splicing del Dscam in un vettore di DNA, i ricercatori possono modificarlo per esprimere qualsiasi gene vogliano in base alle opzioni di splicing disponibili. Questo consente agli scienziati di sfruttare l'unica capacità del Dscam di produrre molte proteine diverse.

Utilizzando questo sistema, i ricercatori possono facilmente manipolare l'espressione genica per controllare meglio come e quando certe proteine vengono prodotte in una cellula. Il PXGS può consentire lo studio di più di un gene alla volta.

#Verifica dello Splicing del Dscam in PXGS

Prima di utilizzare il PXGS, era importante verificare che lo splicing unico del Dscam funzionasse correttamente. I ricercatori hanno effettuato test inserendo parti del gene Dscam in un nuovo costrutto di DNA. Volevano assicurarsi che il processo di splicing rimanesse intatto quando si usava un promotore specifico che consente l'espressione controllata. I risultati hanno confermato che le varianti desiderate del Dscam sono state prodotte come previsto.

#Proteine Fluorescenti e Sostituzione Genica

I ricercatori hanno anche testato la possibilità di inserire geni diversi nel framework del Dscam. Sostituendo specifici esoni del Dscam con geni che producono proteine fluorescenti, potevano tracciare dove e come queste proteine vengono espresse all'interno delle cellule. I test iniziali hanno mostrato che non solo potevano sostituire esoni con geni fluorescenti, ma il sistema funzionava comunque correttamente, indicando che le sequenze specifiche del Dscam non erano strettamente necessarie per lo splicing.

#Espressione Multi-Colore nelle Cellule

Il sistema PXGS consente l'espressione simultanea di più proteine fluorescenti all'interno di un singolo tipo di cellula. Negli esperimenti condotti, questo setup è riuscito a esprimere con successo quattro diversi colori di proteine fluorescenti per distinguere cellule specifiche.

Applicando questo metodo a cellule neuronali, i ricercatori hanno scoperto che la fluorescenza si diffondeva in tutti i neuroni previsti, mostrando un'espressione efficace delle diverse proteine. Tuttavia, mentre il sistema funzionava bene, hanno riscontrato che la luminosità dei colori individuali era inferiore alle aspettative a causa della distribuzione dell'espressione tra più proteine.

#Utilizzo del PXGS Oltre ai Neuroni

Poiché il Dscam viene espresso in vari tessuti, non solo nelle cellule neuronali, i ricercatori miravano a testare il PXGS anche in altri tipi di cellule. Hanno progettato con successo un costrutto PXGS multi-colore che consentiva l'espressione di più fluorescenti in diverse cellule. Incrociando le linee PXGS con diversi driver Gal4, potevano etichettare sia cellule neurali che non neurali in tutto l'organismo.

#Espressione Funzionale nell'Organizzazione Tissutale

Una parte significativa dell'utilizzo del PXGS era testare se potesse esprimere geni grandi e funzionalmente significativi. I ricercatori hanno selezionato un certo numero di recettori di superficie cellulare e li hanno incorporati nel framework del PXGS per esprimerli erroneamente specificamente nei neuroni sensoriali. Questo ha consentito loro di studiare i modelli di wiring neuronale e come questi recettori interagissero tra loro in vivo.

I risultati di questi test hanno dimostrato che l'espressione errata ha portato a cambiamenti notevoli nella crescita degli assoni e nei modelli di ramificazione. Questi risultati hanno fornito intuizioni su come alcuni recettori influenzino lo sviluppo e la struttura delle connessioni neuronali.

#Conclusione

Il Sistema di Espressione Poly-Transgene (PXGS) offre un nuovo approccio promettente per studiare l'espressione genica e i suoi effetti sui sistemi biologici. Permettendo di esprimere più geni insieme, i ricercatori possono ottenere intuizioni più profonde sulle funzioni cellulari, le interazioni proteiche e i processi di sviluppo negli organismi complessi come le drosophile. Questa tecnologia innovativa ha il potenziale di essere adattata per varie applicazioni nella biologia sintetica e negli studi sull'espressione genica in diverse specie.