Neue Testmethode zur schnellen Erkennung von Pathogenen

Nukleinsäuretests (NATs) sind wichtige Werkzeuge, um Infektionen durch verschiedene Krankheitserreger zu überwachen. Diese Tests suchen nach spezifischer DNA und RNA von diesen Pathogenen, was wichtig ist, um Patienten schnell zu isolieren, Behandlungen bereitzustellen und die Verbreitung von Krankheiten nachzuvollziehen. Während der COVID-19-Pandemie waren NATs entscheidend, um die Virusausbreitung zu managen und zu kontrollieren. Einer der zuverlässigsten Tests ist der Reverse Transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR), der als beste Methode zur Identifizierung von Infektionen angesehen wird. Dieser Test umfasst mehrere Schritte, beginnend mit der Umwandlung von RNA in DNA und dann der Verstärkung dieser DNA durch verschiedene Heizzyklen.

Obwohl RT-qPCR sehr effektiv ist, hat es einige Nachteile. Es ist komplex, benötigt viele Ressourcen und dauert lange, um verarbeitet zu werden. Das macht es weniger ideal für schnelle, vor Ort durchgeführte Tests, die als Point-of-Care (POC) Testing bekannt sind. Die weitverbreitete Nutzung von RT-qPCR während der Pandemie führte auch zu Engpässen bei den notwendigen Materialien und Testkits, was die Bemühungen zur Kontrolle der Krankheit beeinträchtigte.

Aufgrund dieser Herausforderungen gibt es ein wachsendes Interesse an einfacheren und zugänglicheren Testtechnologien, die am Point of Care eingesetzt werden können. Ein idealer POC-Test würde bei konstanter Temperatur arbeiten und somit die Notwendigkeit komplizierter Heizgeräte beseitigen. Eine beliebte Methode ist die Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Andere Methoden sind Nucleic Acid Sequence-based Amplification (NASBA), Recombinase Polymerase Amplification (RPA) und neuere Techniken, die das CRISPR/Cas-System nutzen. Diese Methoden benötigen jedoch oft komplexe Mischungen von Chemikalien und Enzymen, die kostspielig und schwer zu beschaffen sein können, insbesondere in Gebieten mit begrenzten Ressourcen. Ausserdem können sie falsch-positive Ergebnisse liefern, was den Testprozess kompliziert.

Das schafft einen Bedarf nach schnellen, kostengünstigen Tests, die einfach zu verwenden sind und nicht viele Ressourcen benötigen. Toehold-vermittelte Strangverschiebung (TMSD) Kaskaden sind eine vielversprechende Lösung. Bei TMSD bindet ein DNA-Molekül an einen speziellen Bereich (toehold) auf einer anderen DNA-Struktur. Diese Bindung aktiviert einen anderen Strang und kann komplexe Reaktionen antreiben, ohne Enzyme zu benötigen. Einige der gründlicher untersuchten TMSD-Tests beinhalten Catalytic hairpin assembly (CHA) und Hybridization-chain reaction (HCR). Allerdings benötigen TMSD-Tests oft ein sorgfältiges Design und den Einsatz kostspieliger markierter Stränge, um Ergebnisse zu zeigen. Sie können trotzdem unerwartete Ergebnisse aufgrund von Leckagen erzeugen, bei denen das System in Abwesenheit des Ziels reagiert, was es schwierig macht, Signale von tatsächlichen Infektionen zu bestätigen.

Forscher haben auch begonnen, TMSD-Reaktionen mit Enzymen zu mischen und neue Methoden zu entwickeln, die die Expression von RNA oder Proteinen in Tests steuern können. Dieser Ansatz kann Informationen direkt innerhalb biologischer Proben verarbeiten und klarere diagnostische Ergebnisse liefern.

Ermutigt durch diese Fortschritte und den dringenden Bedarf an effektiven Tests während Ausbrüchen machten sich Forscher daran, einen Detektor zu entwickeln, der spezifische Pathogen-DNA und -RNA identifizieren kann. Das Design konzentriert sich auf vier Hauptmerkmale: Einfachheit, Vielseitigkeit, Modularität und Robustheit. Das Endprodukt sollte aus wenigen leicht zugänglichen Komponenten bestehen und idealerweise nur ein Enzym enthalten, in der Lage sein, verschiedene Nukleinsäuresequenzen zu erkennen, anpassbar an zukünftige Ausbrüche sein und eine starke Reaktion auf Zielsequenzen zeigen, ohne von Nicht-Zielen gestört zu werden.

#Materialien und Methoden

#Lösungsmittel und Reagenzien

Alle in dieser Forschung verwendeten Materialien wurden von kommerziellen Quellen bezogen und ohne Änderungen verwendet, sofern nicht anders angegeben. Reines Wasser wurde aus einem Milli-Q-System gewonnen. Die Hauptchemikalien umfassten Ammoniumpersulfat, Tris-EDTA-Puffer und andere Puffer und Farbstoffe von vertrauenswürdigen Lieferanten. Die Studie verwendete ausserdem spezifische Enzyme und DNA-Moleküle, die gemäss den Standardprotokollen vorbereitet und gelagert wurden.

#Design und Analyse von Nukleinsäuren

Das Design der Oligonukleotide und ihrer vorhergesagten Strukturen wurde mit spezifischen Online-Tools durchgeführt. Die Sequenzen wurden sorgfältig aufgrund ihrer potenziellen Effektivität gegen gezielte Pathogene ausgewählt. Dazu gehörte die Auswahl von Sequenzen, die zuvor in anderen Studien identifiziert wurden. Diese Sequenzen wurden direkt in Tests ohne weitere Anpassungen angewendet.

#Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

Um die DNA-Konstrukte zu analysieren, wurde PAGE mit einem speziellen Elektrophoresesystem durchgeführt. Verschiedene Gelprozentsätze wurden basierend auf den Anforderungen des Tests vorbereitet. Proben wurden bei einer festgelegten Spannung ausgeführt, gefärbt und dann abgebildet, um die Ergebnisse zu bestimmen.

#DNA-Konstruktzusammenstellung

Die DNA-Konstrukte wurden erstellt, indem verschiedene Stränge in bestimmten Verhältnissen kombiniert wurden. Diese Proben wurden Wärme- und Kühlzyklen ausgesetzt, um eine ordnungsgemässe Assemblierung zu fördern. Die zusammengesetzten Konstrukte wurden dann bis zur Verwendung gelagert.

#SARS-CoV-2 Mimic RNA-Expression und -Reinigung

Eine virale Mimic-RNA wurde aus einer spezifischen Plasmidvorlage erstellt. Sie durchlief eine Reihe von Schritten, einschliesslich Amplifikation, Reinigung und Qualitätskontrollen, um sicherzustellen, dass sie für Tests geeignet war.

#Strangverschiebungstest

In diesen Experimenten wurden die DNA-Konstrukte und Auslöser in einem Reaktionspuffer gemischt, bei kontrollierten Temperaturen inkubiert und dann analysiert, um die Ergebnisse zu bewerten.

#Nukleinsäurerkennung mittels leaky-reduzierter Konstrukte

Die Erkennung wurde mit sorgfältig zusammengestellten Konstrukten in einem zweistufigen Test durchgeführt. Die Mischung wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Auslösern inkubiert, um die Reaktionen effektiv zu messen.

#Nukleinsäurerkennung mittels leakage-tolerant Assay

Für diesen Test wurden Modifikationen vorgenommen, um die Sensitivität zu erhöhen. Die Proben durchliefen mehrere Schritte, um sicherzustellen, dass nur die gewünschten Signale erkannt wurden, während unerwünschte Hintergrundsignale minimiert wurden.

#Fluoreszenzquantifizierung und statistische Analyse

Die Datenanalyse wurde durchgeführt, um die Effektivität der Tests zu bewerten und zu messen, wie gut sie auf unterschiedliche Konzentrationen der Zielsequenzen reagierten.

#Einführung in die Nukleinsäurerkennungsmethode

Diese Arbeit stellt eine neue Methode zur Erkennung von Nukleinsäuren vor, die TMSD-Kaskaden mit der Erstellung eines fluoreszierenden Aptamers durch T7 RNA-Polymerase kombiniert. Der Prozess beruht auf zwei Haupt-DNA-Konstrukten: einem, das den Zielpathogen erkennt, und einem anderen, das das fluoreszierende Aptamer kodiert.

Der Erkennungsprozess findet in einem einzigen Röhrchen statt, das ein kleines Volumen benötigt. Wenn ein bestimmtes DNA- oder RNA-Ziel vorhanden ist, initiiert es den Prozess, der ein fluoreszierendes Signal erzeugt, ohne zusätzliches Equipment zu benötigen. Im Gegensatz zu vielen anderen Methoden erfordert dieses Verfahren keine markierten DNA-Stränge, da das fluoreszierende Signal durch einen Selbstmontageprozess erzeugt wird, bei dem das Aptamer mit einem spezifischen fluoreszierenden Marker interagiert.

Die anpassungsfähige Natur des Sensors ermöglicht schnelle Änderungen, um verschiedene Pathogene gezielt anzugehen, indem einfach ein Teil des ersten Konstrukts geändert wird.

#Systemdesign

Das Sensor-Design umfasst zwei Hauptkonstrukte. Das erste Konstrukt ist eine pathogen-erkennende DNA-Struktur, die eine Promotor-Domäne enthält. Das zweite Konstrukt enthält eine Sequenz für das Spinach-Aptamer. Diese beiden Konstrukte sind komplementär, aber so entworfen, dass sie in Abwesenheit eines spezifischen Auslösers inaktiv bleiben.

Wenn die Ziel-Nukleinsäure an ihren vorgesehenen Platz bindet, aktiviert sie eine Reaktion. Dies führt zur Produktion des Aptamers, das dann mit dem fluoreszierenden Marker interagiert und ein nachweisbares Signal erzeugt.

#Experimentelle Validierung

Anfängliche Tests umfassten den Vergleich der Reaktion des Systems, wenn es dem spezifischen Auslöser im Vergleich zu einer zufälligen DNA-Sequenz ausgesetzt war. Das Vorhandensein des Auslösers führte zur Produktion eines bemerkbaren fluoreszierenden Signals, während die zufällige Sequenz kein Signal erzeugte, was die Spezifität des Tests demonstrierte. Das System war sensibel genug, um unter geeigneten Testbedingungen klare Ergebnisse anzuzeigen.

Weitere Verfeinerungen führten zu einer verbesserten Leistung. Der Sensor konnte picomolare Konzentrationen spezifischer DNA- und RNA-Moleküle ohne vorherige Amplifikation oder komplexe Prozesse nachweisen.

#Herausforderungen bei der Leckagekontrolle angehen

Trotz der erfolgreichen Ergebnisse zeigte das System anfangs einige unerwünschte Hintergrundsignale, die als Leckage bekannt sind. Diese Leckage kann die Testergebnisse stören, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen der Ziel-Nukleinsäure.

Die Forschung zu den Leckagepfaden entdeckte zwei Hauptphasen der Leckage: eine schnelle Anfangsphase, gefolgt von einer langsameren, fortlaufenden Leckage. Dieses Verständnis führte zu strategischen Verbesserungen im Design, um das Auftreten von Leckage zu reduzieren.

#Verbesserungen

Um die Leistung des Sensors zu verbessern, wurden mehrere Modifikationen eingeführt, darunter:

1. Erweiteretes Design: Verlängerung der Bereiche, die für das Blocken verantwortlich sind, um eine bessere Passform zu schaffen und unerwünschte Interaktionen zu minimieren.
2. Anpassung der Überlappungen: Anpassung der Längen der Überlappungen zwischen den Strängen, um die Stabilität zu erhöhen.
3. Verwendung von mehr Blockierungssträngen: Erhöhung der Anzahl der Blockierungsstränge, um die Fähigkeit des Systems zu verbessern, Kurz- und andere unerwünschte Produkte zu handhaben.
4. Senkung der Konzentrationen: Reduzierung der Konzentration der Konstrukte, um die Wahrscheinlichkeit von Interaktionen zu verringern, wenn sie nicht aktiviert sind.

Diese Änderungen verbesserten die Reaktion des Systems erheblich, reduzierten die Leckageraten und erhöhten die Sensitivität bei Zielkonzentrationen.

#Vielseitige Leistung zur Pathogen-Erkennung

Um die Verbesserungen zu validieren, wurde das System mit verschiedenen Nukleinsäuresequenzen von Krankheitserregern wie dem Zika-Virus und SARS-CoV-2 getestet. Die Ergebnisse bestätigten, dass sowohl DNA als auch RNA auf ähnlichen Sensitivitätsniveaus nachweisbar waren.

Der Sensor schnitt nicht nur bei kurzen Sequenzen gut ab, sondern auch bei grösseren RNA-Nachahmungen, obwohl die Sensitivität bei längeren Strängen aufgrund ihrer strukturellen Komplexität variierte.

#Erfassungsmechanismus zur Leckagekontrolle

Um die Leckage weiter anzugehen, wurde der Ansatz dahingehend geändert, dass Leckageprodukte selektiv erfasst wurden, bevor sie das Signal stören konnten. Modifizierte Blockierungsstränge, die mit magnetischen Perlen zurückgehalten werden konnten, wurden eingesetzt. Dies ermöglichte eine effiziente Entfernung unerwünschter Produkte, während nur die aktiven Komponenten, die notwendig sind, um das fluoreszierende Signal zu erzeugen, erhalten blieben.

Diese selektive Erfassung von Nicht-Zielkomponenten stellte sicher, dass selbst bei vorhandener Leckage das System ein klares Antwortsignal für tatsächliche positive Nachweise beibehielt.

#Fazit

Diese Arbeit führt eine neue Methode zur Erkennung von Nukleinsäuren ein, die auf einem programmierbaren Sensor basierend auf TMSD-Kaskaden beruht. Das Design ermöglicht eine schnelle Anpassung zur gezielten Ansprache verschiedener Krankheitserreger. Sowohl DNA als auch RNA sind in sehr niedrigen Konzentrationen nachweisbar, ohne umfangreiche Vorbereitungen oder zusätzliche Behandlungen zu erfordern.

Der Ansatz zur Handhabung von Leckagen durch selektive Erfassung erhöht die Funktionalität des Sensors erheblich und ermöglicht es ihm, effektiv in realen Anwendungen zu arbeiten. Die Fortschritte, die in dieser Forschung erzielt wurden, ebnen den Weg für zukünftige Anwendungen in der Diagnostik, die über die einfache Erkennung von Krankheitserregern hinausgehen und mögliche Anwendungen in breiteren molekularen Studien umfassen.

Die Kombination aus Einfachheit, Vielseitigkeit und Sensitivität des Systems zeigt vielversprechendes Potenzial für Point-of-Care-Tests und macht es zu einem wertvollen Werkzeug im Kampf gegen Infektionskrankheiten.