Fortschritte in Cryo-TEM und STEM-Technologien

Kryogene Transmissionselektronenmikroskopie, auch bekannt als Kryo-TEM, ist eine mächtige Technik, um die Strukturen biologischer Moleküle mit hoher Auflösung zu studieren. Diese Methode ist besonders nützlich, um makromolekulare Strukturen wie Proteine und Viren in einem nahezu natürlichen Zustand zu untersuchen. Die Proben werden schnell eingefroren, um ihre Struktur zu bewahren, und ermöglichen es Wissenschaftlern, detaillierte Bilder zu erfassen.

#Wie Kryo-TEM funktioniert

Kryo-TEM basiert auf einer Methode, die Phasenkontrastabbildung genannt wird. Dabei werden Bilder in einem leicht unscharfen Zustand aufgenommen. Das Unscharfstellen hilft, Kontrast zu erzeugen, was es einfacher macht, die Details der Proben zu erkennen. Allerdings führt das zu Verzerrungen, die durch rechnerische Methoden korrigiert werden müssen.

Um ein dreidimensionales (3D) Bild der Probe zu erstellen, werden viele Bilder aus verschiedenen Blickwinkeln aufgenommen und dann kombiniert. Diese Technik, die als Einzelpartikelanalyse (SPA) bezeichnet wird, beinhaltet typischerweise die Analyse von Tausenden von molekularen Formen und Orientierungen.

Tomografie, eine weitere Anwendung von Kryo-TEM, nimmt eine Reihe von Bildern aus verschiedenen Winkeln auf, um eine 3D-Rekonstruktion der Probe zu erstellen. Diese Methode ist hilfreich, um das gesamte Volumen des Probenobjekts zu visualisieren.

#Herausforderungen bei Kryo-TEM

Trotz ihrer Vorteile bringt Kryo-TEM einige Herausforderungen mit sich. Ein grosses Problem hängt mit der schwachen Phasenobjekt-Näherung (WPOA) zusammen, die es schwierig machen kann, Intensitäten zuverlässig zu messen. Bei der Rekonstruktion der Struktur einer Probe modellieren Wissenschaftler oft eine begrenzte Anzahl von Bausteinen, wie Aminosäuren.

Ein weiteres Problem ergibt sich, weil Elektronen beim Durchgang durch die Probe Energie verlieren können, was zu chromatischer Aberration führt. Dies führt dazu, dass unterschiedliche Energieverluste in verschiedenen Ebenen scharfgestellt werden, was die endgültigen Bilder verzerrt. Um dem entgegenzuwirken, wird normalerweise ein Energiefilter vor der Kamera platziert, der nur Elektronen durchlässt, die keine Energie verloren haben.

#Einschränkungen der Proben

Wegen dieser Herausforderungen war die hochauflösende strukturelle Analyse biologischer Moleküle weitgehend auf Proben beschränkt, die im Labor vorbereitet wurden. Forscher wollten komplexe Strukturen in lebenden Zellen untersuchen, was zu einer Nachfrage nach verbesserten Techniken führte, um Proben ohne Entfernung aus ihrem natürlichen Umfeld zu analysieren.

#Fortschritte in der Probenvorbereitung

Um der Nachfrage nach In-situ-Analysen gerecht zu werden, sind neue Protokolle für die Vorbereitung von Proben entstanden, die mit Kryogenik konserviert wurden. Zwei gängige Methoden zur Dünnung dieser Proben sind Ultramikrotomie und fokussierte Ionenstrahltechnologie (FIB). Diese Methoden ermöglichen eine höhere Auflösung bei der Abbildung und liefern gleichzeitig einige Informationen über den gesamten zellulären Kontext. Allerdings kann der Dünnungsprozess selbst zu einem Verlust an 3D-Informationen führen.

#Scanning Transmissionselektronenmikroskopie (STEM)

Eine Alternative zur traditionellen Kryo-TEM ist die Scanning Transmissionselektronenmikroskopie (STEM). STEM wird häufiger in der Materialwissenschaft verwendet, findet aber langsam auch im Bereich der biologischen Bildgebung Anwendung. Ein Grund für den Erfolg in der Materialwissenschaft ist, dass Proben oft leichter zu interpretieren sind, wenn sie Elektronen stark streuen.

Allerdings war die Anwendung von STEM auf biologische Proben durch Faktoren wie die Komplexität der Ausrüstung und eine Lernkurve in der Forschungsgemeinschaft begrenzt. Frühere Studien konzentrierten sich mehr auf Massendurchmessungen als auf strukturelle Analysen.

#Das Potenzial von Kryo-STEM

Kryo-STEM, oder Kryo-Scanning Transmissionselektronenmikroskopie, hat sich als eine tragfähige Option für die 3D-Bildgebung biologischer Proben erwiesen, die dicker sind als die typischerweise mit traditionellen Kryo-TEM-Methoden analysierten. Ein Vorteil ist, dass es weniger von chromatischer Aberration betroffen ist, was klarere Bilder ermöglicht.

Mit Kryo-STEM können Wissenschaftler die Streuintensität von Elektronen analysieren, um Einblicke in die Materialzusammensetzung und Struktur von Proben zu gewinnen. Zum Beispiel können schwerere Metallatome wie Eisen oder Zink im Kontext umgebender organischer Proteine identifiziert werden.

#Strahlungsempfindlichkeit und Abbildungstechniken

Ein grosses Anliegen in der Kryo-Mikroskopie ist die Empfindlichkeit der Proben gegenüber Strahlung. Ideal wäre es, dass jedes gestreute oder diffraktierte Elektron wertvolle Daten für die Bildgenerierung liefert. Verschiedene Abbildungstechniken, darunter hochwinkliges ringförmiges Dunkelfeld (HAADF) und hellfeld (BF) Abbildungen, helfen dabei, Elektronen in unterschiedlichen Kontrastmodi zu erfassen.

Eine weitere Technik, die eingeführt wurde, um die Auflösung für biologische Kryo-Elektronenmikroskopie zu verbessern, heisstDifferentialphasen-Kontrast (DPC). Dabei werden spezialisierte Detektoren verwendet, um Phaseninformationen von der Probe zu erfassen.

#Die Rolle der automatisierten Akquisition

Die automatisierte Akquisition ist entscheidend, um strahlungsempfindliche Proben effizient zu handhaben. Die notwendigen Änderungen, um die Probe zu verfolgen und die Bilder zu fokussieren, müssen sorgfältig verwaltet werden, um die Exposition zu reduzieren. Software wie SerialEM hilft dabei, den Datensammelprozess in der Elektronenmikroskopie zu automatisieren.

#Probenvorbereitung von T4-Bakteriophagen

Um praktische Erfahrungen mit diesen Techniken zu sammeln, wurden T4-Bakteriophagen, Viren, die Bakterien infizieren, für die Abbildung vorbereitet. Die Phagen wurden in E. coli gezüchtet und dann durch eine Reihe von Zentrifugations- und Filtrationsschritten isoliert.

Sobald sie isoliert waren, wurden die Proben kryofixiert, indem ein Gerät verwendet wurde, das das Probenmaterial schnell einfriert und ihren natürlichen Zustand bewahrt. EM-Raster wurden verwendet, um die Proben während der Abbildung zu halten. Die Rasters wurden behandelt, um sicherzustellen, dass die Proben richtig haften, bevor sie bis zur Abbildung in flüssigem Stickstoff gelagert wurden.

#Abbildungsprozess

Mit einem Tecnai F20-Mikroskop wurden Bilder der Proben im STEM-Modus aufgenommen. Die Mikroskopeinstellungen wurden sorgfältig kalibriert, und die Probe wurde bei niedriger Temperatur gehalten, um Strahlenschäden zu minimieren. Bilder wurden bei bestimmten Neigungswinkeln gesammelt, um eine umfassende Abdeckung der Probe zu gewährleisten.

Der Datenerfassungsprozess wurde mit SerialEM gesteuert, was die Automatisierung verschiedener Aspekte der Abbildung ermöglichte. Dazu gehörte die Nachverfolgung der Position der Probe und die Sicherstellung, dass der Fokus während des gesamten Abbildungsprozesses genau blieb.

#Datenanalyse

Die Analyse der gesammelten Daten folgt einem bestimmten Protokoll. Der erste Schritt besteht darin, die Daten zu erfassen und in Dateien zu organisieren. Die Daten speichern Bilder, die an jedem Sondenstandort und bei jedem Neigungswinkel aufgenommen wurden.

Weitere Schritte in der Analyse beinhalten das Korrigieren von systematischen Verschiebungen, die während des Abbildungsprozesses aufgetreten sein könnten. Verschiedene Skripte und Softwaretools helfen dabei, die Daten entsprechend zu integrieren und auszurichten.

#Erstellung verbesserter Bilder

Fortgeschrittene Methoden wie die Hauptkomponentenanalyse (PCA) werden angewendet, um den Kontrast der Bilder zu verbessern. Durch die Untersuchung der verschiedenen Komponenten des Datensatzes und wie sie zum Gesamtbild beitragen, können Forscher klarere Visualisierungen der Strukturen erzeugen.

#Die Vorteile von 4D-STEM

4D-STEM ermöglicht es Forschern, reichhaltige Daten über die Proben zu sammeln. Anstatt sich ausschliesslich auf Durchschnittstechniken zu verlassen, können verschiedene Kontraste aus einem einzigen Datensatz extrahiert werden. Diese Flexibilität bietet das Potenzial für tiefere Einblicke in die untersuchten Materialien.

Neben der Bereitstellung von hochauflösenden Bildern kann die Kombination verschiedener Kontrastmethoden einzigartige Merkmale der Proben offenbaren. Forscher können die Strukturen einzelner Viren oder Proteine untersuchen, ohne dabei Details zu verlieren, selbst solche, die durch traditionelle Durchschnittsmethoden übersehen werden könnten.

#Fazit

Die Fortschritte in Kryo-TEM- und STEM-Technologien haben die Art und Weise, wie Wissenschaftler biologische Proben untersuchen, revolutioniert. Durch die Nutzung von Methoden wie Kryo-STEM und automatisierter Datenerfassung können Forscher komplexe Strukturen in ihren natürlichen Umgebungen untersuchen. Die Fähigkeit, Proben ohne Durchschnittsbildung zu analysieren, hat neue Türen zum Verständnis der molekularen Maschinerie des Lebens geöffnet.

Während Forscher weiterhin diese Techniken verfeinern und das Potenzial der Kombination verschiedener Abbildungsmodalitäten erkunden, versprechen die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse vielversprechende Anwendungen in der Biologie und Medizin. Das sich entwickelnde Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie bietet weiterhin aufregende Möglichkeiten für die Abbildung auf molekularer Ebene.