Neue mScarlet-Varianten verbessern die Forschung in C. elegans

MScarlet ist eine Art von rotem fluoreszierendem Protein, das häufig in der Forschung verwendet wird. Es hat einige Vorteile im Vergleich zu älteren roten fluoreszierenden Proteinen. In einem kleinen Wurm namens C. Elegans ist mScarlet viel heller als ein anderes Protein namens TagRFP-T. Diese Helligkeit hilft Wissenschaftlern, besser zu sehen, was in Zellen passiert. Ausserdem verringert mScarlet, wenn es mit anderen Farben von fluoreszierenden Proteinen wie grün verwendet wird, die Wahrscheinlichkeit von verwirrenden Signalen. Ein weiterer Vorteil von mScarlet ist, dass es als Einheit funktioniert, was bedeutet, dass es sich nicht in Teile zersetzt, wie das bei einigen älteren roten fluoreszierenden Proteinen der Fall ist.

#Das Problem mit langsamer Reifung

Ein Challenge bei den meisten roten fluoreszierenden Proteinen, einschliesslich mScarlet, ist, dass sie lange brauchen, um vollständig einsatzbereit zu sein. Grüne fluoreszierende Proteine sind viel schneller und werden in etwa 30 Minuten oder weniger bei Körpertemperatur einsatzbereit. Im Gegensatz dazu können viele rote fluoreszierende Proteine mehrere Stunden brauchen, um bereit zu sein. Dieser langsame Prozess kann es schwierig machen, schnelle Veränderungen bei lebenden Organismen wie C. elegans zu beobachten. Wichtige Ereignisse im Leben dieses Wurms passieren schnell, also brauchen Wissenschaftler schnell wirkende fluoreszierende Proteine, um Schritt zu halten.

#Neue Varianten von mScarlet

Kürzlich wurden neue Versionen von mScarlet entwickelt, die mScarlet3 und mScarlet-I3 heissen. Diese neuen Proteine sind so konzipiert, dass sie viel schneller reifen und dabei hohe Helligkeitsniveaus beibehalten. Sie behalten ähnliche Farben wie das ursprüngliche mScarlet. In Tests mit Zellen wurde festgestellt, dass mScarlet3 heller war und viermal schneller reifte als das ursprüngliche mScarlet. Währenddessen reifte mScarlet-I3 am schnellsten, hatte jedoch einen leichten Abfall in der Helligkeit.

#Studie über mScarlet-Varianten in C. elegans

In dieser Studie haben Forscher diese neueren Versionen von mScarlet genommen und für die Verwendung in C. elegans optimiert. Sie haben verschiedene Versionen der Würmer kreiert, die diese neuen Proteine in ihre DNA integriert haben. Das ermöglichte es ihnen, zu vergleichen, wie hell und wie schnell diese Proteine reiften im Vergleich zu dem älteren mScarlet und grünen fluoreszierenden Proteinen.

#C. elegans züchten

Die Würmer wurden bei 20°C auf speziellen Wachstumsplatten gehalten, die Nahrung bereitstellten. Verschiedene Versionen der Würmer wurden erstellt, jede mit einem einzigartigen fluoreszierenden Protein, das an spezifischen Stellen in ihren Genen eingesetzt wurde. Diese Einsätze helfen Wissenschaftlern, zu studieren, wie diese Proteine innerhalb der Organismen funktionieren.

#So sammelt und präpariert man Embryonen

Um die Würmer zu studieren, sammelten die Forscher Embryonen, die die frühen Entwicklungsstadien der Würmer sind. Sie verwendeten verschiedene Methoden, um die Embryonen zu handhaben, einschliesslich Dissektion und sanftem Waschen. Sobald sie vorbereitet waren, wurden die Embryonen auf Objektträger gelegt, bereit fürs Imaging. Auch adulte Würmer wurden auf ähnliche Weise zur Beobachtung vorbereitet. Die Wissenschaftler nutzten hochwertige Mikroskope, um klare Bilder von den Würmern und ihren Zellstrukturen zu bekommen.

#Bildanalyse

Als die Bilder aufgenommen wurden, konzentrierten sich die Forscher auf bestimmte Bereiche der Würmer, um zu messen, wie hell die fluoreszierenden Signale waren. Sie verwendeten Software, um die Bilder zu analysieren und die Helligkeit verschiedener fluoreszierender Proteine zu vergleichen. Das ermöglichte es ihnen, zu bestimmen, welche Proteine in Bezug auf Helligkeit und Sichtbarkeit besser abschnitten.

#mScarlet3 zeigt hohe Helligkeit

In Experimenten, die die Helligkeit von mScarlet3, mScarlet-I3 und mScarlet verglichen, zeigte sich, dass mScarlet3 etwa 50% heller ist als das ursprüngliche mScarlet-Protein. Währenddessen war mScarlet-I3 etwa 30% dunkler. Diese Informationen stimmten mit früheren Laborergebnissen überein, was die Zuverlässigkeit dieser neuen Proteine bestätigt.

#mScarlet-I3 reift schnell

Die Forscher untersuchten auch, wie schnell die neuen Proteine in den Embryonen reiften. Sie schauten sich die Proteinexpression während der frühen Entwicklung der Embryonen an. Das grüne fluoreszierende Protein zeigte sich zu Beginn in niedrigen Konzentrationen und stieg während der Entwicklungsphasen weiter an. Im Gegensatz dazu erschien das ursprüngliche mScarlet-Protein sehr schwach und brauchte lange, um in den frühen Embryonen sichtbar zu werden.

#mScarlet-I3 funktioniert gut in verschiedenen Kontexten

Um mScarlet-I3 weiter zu testen, taggten die Forscher ein anderes Gen, das für die Herstellung eines spezifischen Proteins verantwortlich ist. Dies wurde mit einer Technik durchgeführt, bei der das fluoreszierende Protein nicht direkt an das Gen selbst angeheftet wurde. Stattdessen wurde ein separates Signal verwendet, um sie auf eine Weise zu verbinden, die eine ordnungsgemässe Expression gewährleistete.

Als diese modifizierten Würmer analysiert wurden, fanden die Forscher heraus, dass mScarlet-I3 ein klares und helles Signal in verschiedenen Zelltypen lieferte. Zum Beispiel war in bestimmten Darmzellen das fluoreszierende Signal viel klarer im Vergleich zum grünen fluoreszierenden Protein. Diese höhere Klarheit ermöglichte es Wissenschaftlern, angrenzende Strukturen einfacher zu erkennen.

#Vergleich von mScarlet-I3 und GFP

Die Studie zeigte, dass mScarlet-I3 im Vergleich zum grünen fluoreszierenden Protein in Bezug auf Helligkeit und Klarheit überdurchschnittlich abschneidet. Obwohl das grüne Protein in einigen Fällen schneller sichtbar war, machte mScarlet-I3 die leicht langsamere Ansammlung wett, indem es ein viel klareres Signal und weniger Hintergrundrauschen lieferte.

#Taggen von neuronalen Proteinen

Zuletzt taggten die Forscher ein Protein, das in allen Neuronen vorhanden ist, mithilfe von mScarlet-I3 und grünem fluoreszierendem Protein. Sie beobachteten, dass beide Proteine im Nervensystem der Würmer sichtbar waren. Auch hier zeigte mScarlet-I3 weniger Hintergrundrauschen, was die Beobachtung der Neuronen erleichterte.

#Fazit

Die Ergebnisse zeigen, dass mScarlet-I3 ein vielversprechendes Werkzeug für Wissenschaftler ist, die C. elegans studieren. Es reift schnell und bietet ein helles Signal, das die Sichtbarkeit in komplexen lebenden Geweben verbessern kann. Während mScarlet3 möglicherweise eine höhere Helligkeit bietet, hebt sich mScarlet-I3 durch seine Gesamtwirksamkeit hervor, indem es Hintergrundrauschen reduziert und Wissenschaftlern ermöglicht, dynamische Prozesse in Echtzeit zu beobachten. Das macht mScarlet-I3 zu einer idealen Wahl für Forscher, die zuverlässige visuelle Marker in ihren Studien benötigen.