Fortschritte in der Kardiomyozytenforschung mit hiPSC-KMs

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die Hauptursache für Krankheit und Tod weltweit und führen jedes Jahr zu etwa 18 Millionen Todesfällen. Das Herz besteht aus verschiedenen Zelltypen, wobei die Kardiomyozyten am häufigsten vorkommen. Bei Erwachsenen sind diese Zellen so angeordnet, dass das Herz das Blut effektiv pumpen kann. Erwachsene Kardiomyozyten haben eine spezielle Form und Struktur, die es ihnen ermöglicht, richtig zu funktionieren. Allerdings gibt es Herausforderungen, wenn man diese Zellen direkt aus menschlichen Herzen studieren will, wie begrenzte Verfügbarkeit und Schwierigkeiten, sie im Labor am Leben zu halten.

Um diese Herausforderungen zu meistern, nutzen Wissenschaftler eine Art von Zellen, die HiPSC-CMs genannt werden, die aus menschlichen Stammzellen stammen. Diese Zellen können in grossen Mengen gezüchtet werden und liefern wertvolle Einblicke in Herzkrankheiten und mögliche neue Behandlungen. Allerdings sind hiPSC-CMs weniger ausgereift als erwachsene Kardiomyozyten und haben andere Eigenschaften. Forscher arbeiten daran, bessere Umgebungen für das Wachstum dieser Zellen im Labor zu schaffen, die den Bedingungen eines gesunden Herzens ähneln.

#Die richtige Umgebung schaffen

Ein ideales Setup für das Wachstum von Kardiomyozyten umfasst die Verwendung eines Substrats, das die Textur und Steifigkeit von Herzgewebe nachahmt. Dieses Substrat sollte die Anheftung und das Wachstum von Kardiomyozyten unterstützen, ihnen helfen, sich richtig auszurichten, und die natürliche Bewegung des Herzens berücksichtigen. Die Steifheit des Substrats sollte der von gesundem Herzgewebe entsprechen, was bei jungen Herzen zwischen 1-6 kPa und bei gesunden Erwachsenen zwischen 10-15 kPa variiert.

Um solche Substrate herzustellen, nutzen Forscher verschiedene Techniken, darunter weiche Lithografie und Mikrofabrikation. Ein populäres Material für die Herstellung dieser Substrate ist Polydimethylsiloxan (PDMS), das für seine Stabilität, Biokompatibilität und niedrigen Kosten bekannt ist. Obwohl PDMS viele Vorteile hat, kann es für Kardiomyozyten schwierig sein, auf seiner Oberfläche zu haften, da PDMS von Natur aus hydrophob ist.

Um die Zellanhaftung zu verbessern, haben Forscher Methoden entwickelt, um die Oberfläche von PDMS zu modifizieren, damit sie besser für das Zellwachstum geeignet ist. Diese Modifikationen beinhalten die Beschichtung der Oberfläche mit Proteinen, die helfen, dass die Zellen besser haften.

#Methoden der Herstellung

Der Prozess zur Herstellung des weichen mikromusterierten Substrats umfasst mehrere Schritte. Zuerst wird eine Form aus PDMS erstellt, was eine sorgfältige Ätzung erfordert, um Rillen zu formen. Diese Rillen leiten die Zellen dazu, sich in der gewünschten Ausrichtung zu wachsen. Sobald die Form bereit ist, wird eine Schicht eines Materials namens Polyvinylalkohol (PVA) aufgetragen, um die spätere Entfernung des PDMS-Substrats zu erleichtern.

Danach wird eine weichere Version von PDMS in die Form gegossen. Anschliessend wird das Substrat behandelt, um seine Oberflächen Eigenschaften zu verbessern, bevor es für die Zellkultur verwendet wird. Forscher nutzen verschiedene Techniken, um sicherzustellen, dass die Tiefe und der Abstand der Rillen konsistent sind, da diese Merkmale beeinflussen, wie die Zellen wachsen und sich verhalten.

#Charakterisierung des Substrats

Um sicherzustellen, dass die Substrate für die Kultivierung von Kardiomyozyten geeignet sind, messen Forscher Aspekte wie Rillentiefe und Oberflächenstruktur. Diese Charakterisierungen helfen zu verstehen, wie das Substrat das Zellwachstum und die Zellfunktion beeinflussen könnte.

Sie führen auch Tests durch, um die Steifigkeit der Substrate zu messen, da unterschiedliche Steifigkeitsgrade verschiedene Reaktionen in den Zellen hervorrufen können. Diese mechanische Charakterisierung ist entscheidend, da sie hilft, vorherzusagen, wie die Zellen während der Experimente auf das Substrat reagieren.

#Verbesserung der Zellanhaftung

Die Zellanhaftung an dem Substrat ist entscheidend für erfolgreiche Studien mit Kardiomyozyten. Forscher messen, wie gut die Zellen an verschiedenen Substrattypen haften. Sie stellen fest, dass Substrate, die mit speziellen Beschichtungen wie Proteinen behandelt wurden, die Fähigkeit der Zellen, sich anzuhängen und zu wachsen, erheblich verbessern.

Ein erfolgreicher Ansatz war, eine Kombination aus PD und extrazellulären Matrix (ECM)-Proteinen aufzutragen. Die Behandlung des Substrats auf diese Weise ermöglicht es Kardiomyozyten, eine stabile und funktionale Monolayer zu bilden. Diese Schicht ist entscheidend, um ihre elektrische Aktivität und kontraktile Verhalten zu untersuchen.

#Differenzierung von Stammzellen zu Kardiomyozyten

Um Kardiomyozyten zu produzieren, leiten Forscher sie aus hiPSCs ab. Diese Stammzellen durchlaufen eine Reihe von Schritten, zunächst indem sie auf einer Oberfläche plattiert werden, die mit speziellen Proteinen beschichtet ist, um ihr Wachstum zu unterstützen. Nach einer gewissen Zeit wird das Medium gewechselt, um die Zellen zur Differenzierung in Kardiomyozyten zu animieren. Die Zellen erreichen nach einigen Tagen einen Reifezustand, der Eigenschaften aufweist, die denen von adulten Herz Zellen ähnlich sind.

Während dieses Differenzierungsprozesses überwachen Wissenschaftler die Zellen genau, um sicherzustellen, dass sie sich richtig entwickeln. Das Ziel ist es, eine hohe Reinheit von Kardiomyozyten zu erreichen, was zuverlässigere Ergebnisse in nachfolgenden Experimenten ermöglicht.

#Auswirkungen der Substratmerkmale auf das Zellverhalten

Forscher untersuchen, wie Merkmale des mikromusterierten Substrats, wie Rillengrössen, die Kardiomyozyten beeinflussen. Sie prüfen, wie sich unterschiedliche Musterdimensionen auf die Ausrichtung der Zellen und ihrer Zellkerne auswirken. Ein entscheidender Befund ist, dass bestimmte Parameter, wie Rillentiefe und Abstand, eine bessere Ausrichtung und Funktionalität von Kardiomyozyten fördern.

In ihren Experimenten beobachten die Forscher, dass die beste Leistung bei bestimmten Mikromuster-Dimensionen auftritt. Die auf diesen optimalen Mustern kultivierten Zellen zeigen eine verbesserte Organisation und Funktion, die dem Verhalten von adulten Kardiomyozyten näher kommen.

#Reifung der Kardiomyozyten

Das Kultivieren von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten auf speziell entworfenen Substraten ermöglicht es den Forschern, die Reifung weiter voranzutreiben. Sie beobachten über Zeit Veränderungen in Eigenschaften wie der Sarcomerorganisation, kontraktilen Kraft und Kalziumhandhabung.

Nach einigen Wochen auf dem weichen mikromusterierten Substrat zeigen die Kardiomyozyten eine verbesserte strukturelle Organisation. Diese Reifung äussert sich in verbesserten Sarcomerlängen und -orientierungen, die für eine effektive Herzfunktion unerlässlich sind. Die Forscher stellen auch fest, dass die Fähigkeit der Zellen, Kalzium zu handhaben, sich verbessert, was zu einer besseren Kontraktilität führt.

#Evaluierung der Funktionalität

Die Funktionalität der kultivierten Kardiomyozyten wird mit verschiedenen Techniken bewertet. Durch die Analyse ihrer Kontraktions- und Entspannungsraten bestimmen die Forscher, wie gut diese Zellen das Verhalten von adulten Herz Zellen nachahmen. Tests messen Parameter wie Sarcomerkürzung und Kalziumtransienten, was Einblicke in die Gesamtleistung der Zellen liefert.

Diese Bewertungen sind entscheidend, um zu verstehen, wie gut die kultivierten Zellen zur Untersuchung von Herzkrankheiten oder zur Prüfung neuer Medikamente verwendet werden können.

#Langzeitkultivierung

Ein wichtiger Aspekt der Forschung ist die Fähigkeit, Zellen über längere Zeiträume zu kultivieren, manchmal über drei Monate hinaus. Langzeitbeobachtungen helfen Wissenschaftlern zu verstehen, wie sich Kardiomyozyten im Laufe der Zeit verändern und wie ihre Funktionen durch das Mikroenvironment beeinflusst werden könnten.

Während Langzeitstudien überwachen die Forscher Veränderungen in Zellstruktur und -funktion und identifizieren Reifepunkte und Anzeichen von Dedifferenzierung. Dieses Wissen ist entscheidend, um stabile Modelle für das Studium von Herzkrankheiten und Medikamentenreaktionen zu etablieren.

#Entwicklung nützlicher Techniken

Im Laufe der Studie wurden verschiedene Techniken und Verfahren entwickelt, um effektive Umgebungen für das Kultivieren von Kardiomyozyten zu schaffen. Diese Methoden ermöglichen es den Forschern, stabile, funktionsfähige Zellmodelle zu produzieren, die Einblicke in die Herzentwicklung, Krankheiten und mögliche Therapien bieten können.

Ein wichtiger Fortschritt ist die Fähigkeit, mikromusterierte Substrate auf einfache Weise ohne den Bedarf an komplexen Reinraum-Einrichtungen zu erstellen. Diese Zugänglichkeit fördert weitere Experimente und Innovationen in diesem Bereich.

#Zukünftige Richtungen

In Zukunft planen die Forscher, ihr Verständnis zu erweitern, indem sie untersuchen, wie verschiedene Umweltfaktoren das Verhalten von Kardiomyozyten beeinflussen. Es gibt einen Fokus auf die Erkundung von 3D-Strukturen, die die Bedingungen im tatsächlichen Herzgewebe besser nachahmen könnten.

Darüber hinaus könnte die Untersuchung der Proteinexpression in Stammzellen und Kardiomyozyten Einblicke geben, wie sich diese Zellen an verschiedene Umgebungen anpassen. Solche Studien sind entscheidend, um den Bereich der regenerativen Medizin voranzutreiben und die Behandlung von Herzkrankheiten zu verbessern.

#Fazit

Diese Forschung hebt die Bedeutung hervor, optimale Umgebungen für hiPSC-CMs zu schaffen, um deren Reifung und Funktionalität zu verbessern. Durch die Entwicklung neuartiger mikromusterter Substrate mit spezifischen mechanischen Eigenschaften haben Wissenschaftler den Weg für neue Techniken zur Untersuchung von Herzkrankheiten und zur Prüfung potenzieller Behandlungen geebnet.

Die Fähigkeit, Zellen über längere Zeiträume zu kultivieren und gleichzeitig ihre Funktionalität zu erhalten, ist ein bedeutender Fortschritt. Diese Arbeit verspricht zukünftige Anwendungen in der kardialen Gewebeengineering und der Arzneimittelentdeckung und trägt letztendlich zu besseren Ergebnissen für Patienten mit Herzkrankheiten bei.