Fortschritte bei der Proteinanalyse mit BONCAT

Die Massenspektrometrie (MS) hilft Wissenschaftlern dabei, Proteine in komplexen biologischen Proben zu untersuchen. Mit diesem Ansatz konnten Forscher wichtige Veränderungen der Proteinlevel durch verschiedene biologische Aktivitäten entdecken. Allerdings kann es herausfordernd sein, kleine Änderungen in Proteinen in Geweben oder Zellen zu identifizieren. Eine Methode, um dieses Problem anzugehen, nennt sich Biorthogonale Nichtkanonische Aminosäure-Markierung (BONCAT), die es ermöglicht, Proteine zu markieren, die in einem bestimmten Zeitraum produziert wurden.

#Was ist BONCAT?

BONCAT nutzt spezielle Aminosäuren, die nicht natürlich in Proteinen vorkommen. Diese Aminosäuren werden verwendet, um neue Proteine zu taggen, die während eines bestimmten Zeitraums hergestellt werden. Die Idee dahinter ist, dass neu gebildete Proteine anders auf biologische Veränderungen reagieren als ältere Proteine. Wenn sich Forscher auf diese neuen Proteine konzentrieren, können sie die Verwirrung vermeiden, die durch das Mischen alter und neuer Proteine entsteht, was es einfacher macht, Veränderungen zu erkennen, die sonst übersehen werden könnten.

Die am häufigsten verwendete nicht-kanonische Aminosäure für diese Methode ist Azidohomoalanin (AHA). Wenn Forscher AHA zu Zellen hinzufügen, wird es in neue Proteine eingebaut, anstelle der regulären Aminosäure Methionin, die in vielen Proteinen natürlich vorhanden ist. Das passiert, weil Methionin mit AHA um die Einbau in Proteine konkurriert. Da Methionin für das Überleben der Zellen wichtig ist, können Forscher es während der Experimente nicht vollständig entfernen, aber sie können seine Menge reduzieren, um AHA effektiver nutzen zu können.

#Verwendung von AHA in verschiedenen Organismen

Ursprünglich wurde AHA hauptsächlich in kultivierten Zellen verwendet, aber mittlerweile wird es auch in Studien mit komplexeren Organismen wie dem Fadenwurm C. elegans und Mäusen angewendet. Studien zeigen, dass AHA-markierte Proteine ähnlich wie ihre natürlichen Gegenstücke reagieren. Das bedeutet, dass sie die gleiche Struktur, Stabilität und Funktion haben. Untersuchungen haben ergeben, dass diese AHA-Proteine auf biologische Veränderungen genauso reagieren wie unmodifizierte Proteine.

Eine weitere nicht-kanonische Aminosäure, die Selektivität bietet, ist Azidonorleucin (ANL). ANL braucht eine modifizierte Version des Methionin-tRNA-Synthetase, um richtig in Proteine eingebaut zu werden. Diese Methode ermöglicht es Wissenschaftlern, gezielt bestimmte Zellen zu untersuchen, wenn sie Proteine analysieren, was zu fokussierteren Einblicken führt.

#Das DidBIT-Protokoll

Um die Analyse von Proteinen mit AHA zu verbessern, nutzten wir eine Strategie namens DidBIT (Direkte Erkennung von Biotin-haltigen Tags). Bei DidBIT werden die AHA-markierten Peptide mithilfe spezieller Kügelchen angereichert, die stark an Biotin binden. Nachdem die Peptide an diese Kügelchen gebunden wurden, können die Forscher alles andere wegwaschen und sich nur auf die markierten Peptide konzentrieren. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Empfindlichkeit der Analyse zu erhöhen und es uns zu ermöglichen, geringere Mengen an Proteinen nachzuweisen.

In unseren Experimenten verglichen wir, wie gut zwei Arten von Biotin-Tags funktionierten: ein spaltbares und ein nicht-spaltbares. Indem wir unterschiedliche Mengen an AHA-markiertem Hirngewebe verwendeten, konnten wir sehen, welche Methode besser funktionierte.

#Methoden

Wir kultivierten zwei Zelltypen bei kontrollierten Temperaturen und CO2-Werten. Nachdem wir diese Zellen vorbereitet hatten, transfizierten wir sie mit einem modifizierten Gen, um das mMetRS einzuführen. Dies führte zur Einführung der modifizierten Methode für den Einbau der speziellen Aminosäuren.

Nachdem die Zellen entweder mit AHA oder ANL behandelt wurden, führten wir eine Reihe von Schritten durch, um die Proteine zu extrahieren und zu analysieren. Dazu verwendeten wir einen Sonikator, um die Zellen aufzubrechen und die Proteine mit Probenpuffern zu vermischen. Danach nutzten wir Elektrophorese, um die Proteine nach Grösse zu trennen und übertrugen sie auf spezielle Membranen für weitere Analysen.

Anschliessend kennzeichneten wir die Proteine und quantifizierten sie mit einer Methode namens fluoreszenzaktivierte Zelltrennung (FACS). Diese Methode ermöglichte es uns, Zellen zu isolieren, die erfolgreich die modifizierten Gene aufgenommen hatten.

Für Experimente mit Tieren hielten wir Mäuse in kontrollierten Umgebungen. Die Tiere wurden mit Diäten gefüttert, die entweder AHA oder ANL enthielten. Nach der Behandlung sammelten wir die Gehirne, um zu analysieren, wie gut diese nicht-kanonischen Aminosäuren in Proteine eingebaut wurden.

#Ergebnisse: Vergleich von AHA und ANL

In unserer Analyse fanden wir heraus, dass der Einbau von AHA in Gegenwart von Methionin nahezu ausgeschlossen war, während ANL nur eine leichte Reduktion zeigte. Das deutete darauf hin, dass der Einbau von ANL effizienter war als der von AHA, wenn Methionin vorhanden war. Insgesamt wurde jedoch AHA erfolgreicher in Proteine eingebaut als ANL.

Unsere Tests zeigten, dass der spaltbare Biotin-Tag (DADPS) effektiver bei der Detektion von AHA-markierten Peptiden war als der nicht-spaltbare Biotin-Tag (UnC). Als wir unterschiedliche Mengen an Hirngewebe analysierten, identifizierte DADPS konsistent mehr Peptide als UnC, was seine Empfindlichkeit unterstreicht.

#Die Rolle der TMT-Markierung

Wir untersuchten auch, ob TMT, eine Markierungstechnik zur Quantifizierung von Proteinen, unsere Ergebnisse mit AHA-markierten Peptiden beeinflussen würde. Als wir dies mit beiden Biotin-Tags testeten, stellten wir fest, dass DADPS immer noch besser abschnitt als UnC und mehr AHA-Peptide identifizierte, selbst als TMT angewendet wurde. Das deutet darauf hin, dass DADPS mit Proteinquantifizierungstechniken kompatibel ist und gleichzeitig seine Effektivität beibehält.

#Unterschiede zwischen DADPS- und UnC-Peptiden

Als wir die Daten aus unseren Experimenten untersuchten, bemerkten wir signifikante Unterschiede zwischen den beiden Peptidtypen. Die DADPS-Peptide eluieren effizienter von den Kügelchen im Vergleich zu UnC-Peptiden, was einer der Gründe für die bessere Leistung von DADPS sein könnte.

Darüber hinaus fanden wir heraus, dass DADPS-Peptide eine breitere Verteilung im chromatografischen Profil zeigten, was bedeutet, dass sie während der Analyse besser getrennt wurden. Im Gegensatz dazu erschienen UnC-Peptide später, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise weniger stabil waren oder während der MS-Analyse schlecht fragmentiert wurden.

Dieser Fragmentierungsunterschied zeigte sich in unserem Bewertungssystem zur Peptididentifizierung. DADPS-Peptide erhielten höhere Punktzahlen, was bedeutete, dass sie zuverlässiger erkannt wurden als die grösseren UnC-Peptide, die aufgrund ihrer Grösse Schwierigkeiten hatten.

#Zusammenfassung und Fazit

Zusammenfassend bietet der BONCAT-Ansatz mit DADPS zur Kennzeichnung von Proteinen eine verbesserte Empfindlichkeit zur Erkennung neu synthetisierter Proteine im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Die Effizienz von AHA bei der Proteineinbindung, selbst in Gegenwart von Methionin, hebt ihre Nützlichkeit bei der Untersuchung der Protein-Dynamik in Zellen hervor.

Durch die Verfeinerung unserer Methoden und den Vergleich verschiedener Biotin-Tags können wir unser Verständnis der Proteinfunktion in komplexen biologischen Systemen verbessern. Diese Arbeit ebnet den Weg für detailliertere Studien über Proteine in verschiedenen Organismen und Bedingungen, was potenziell zu neuen Erkenntnissen in der biologischen Forschung und Medizin führen könnte.