Herausforderungen und Erkenntnisse in der Next-Generation Sequenzierung

Nächste-Generation-Sequenzierung (NGS) ist ne coole Technologie, um DNA zu analysieren. Sie ermöglicht es Wissenschaftlern, Millionen von DNA-Varianten auf einmal zu betrachten, was sie für genetische Diagnosen unverzichtbar macht. In den Vereinigten Staaten haben viele Laboratorien und Firmen ihre eigenen Tests mit NGS entwickelt, um genetische Erkrankungen zu erkennen, was ordentlich Umsatz generiert. Diese Technologie hat dazu beigetragen, viele Mutationen im Zusammenhang mit Krebs und anderen Krankheiten zu identifizieren.

Trotz ihres weit verbreiteten Einsatzes produziert NGS manchmal Fehler. Berichte zeigen, dass verschiedene NGS-Plattformen falsche Ergebnisse von 0,26% bis 12,86% haben können. Zum Beispiel fand eine Studie mit 20.000 Proben eine falsch-positive Fehlerquote von ca. 1,3%. Das bedeutet, dass in 1,3% der Fälle die Tests fälschlicherweise Mutationen identifizierten, die nicht wirklich vorhanden waren. Deshalb empfehlen Forscher, diese Ergebnisse mit einer anderen Methode, der Sanger-Sequenzierung, zu bestätigen.

Ein weiteres Problem sind die falsch-negativen Fehler, die passieren, wenn ein Test eine tatsächlich vorhandene Mutation nicht erkennt. In einer anderen Studie fand die gesamte Exom-NGS eine falsch-negative Quote von 40-45%. Das deutet darauf hin, dass NGS viele Mutationen übersehen könnte, was zu Fehldiagnosen oder unangemessenen Behandlungen führen kann. Sowohl die hohen falsch-positiven als auch die falsch-negativen Raten zeigen, wie wichtig eine verbesserte Bewertung von NGS-Tests ist, um ihre Zuverlässigkeit sicherzustellen.

#Regulierung der NGS-Tests

Die Food and Drug Administration (FDA) hat Richtlinien herausgegeben, um die Regulierung von NGS-Tests im klinischen Bereich zu verbessern. NGS-Labors in den Vereinigten Staaten werden von den Centers for Medicare and Medicaid Services (CMS) überwacht und müssen die Vorschriften der Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) einhalten.

Es gab mehrere Studien, die sich mit der Aufrechterhaltung der Qualität von NGS-Technologien beschäftigt haben. Projekte wie SEQC2 haben wertvolle Daten zur Qualität der Krebs-Mutationsdetektion durch verschiedene Sequenzierungsmethoden geliefert. Diese Studien betonen die Bedeutung von Referenzproben für eine genaue Sequenzierung und bewerten auch die Leistung verschiedener NGS-Plattformen. Insgesamt unterstützen diese Bemühungen die Notwendigkeit einer besseren Validierung und Standardisierung in NGS-Technologien.

#Herausforderungen bei Tumortests mit NGS

Gezielte NGS (T-NGS) ist in klinischen Umgebungen zur Erkennung von Mutationen in Tumorproben gängig geworden. Diese Infos sind entscheidend für die Wahl der richtigen Krebsbehandlung. Jedoch ist es komplizierter, Mutationen in Tumoren zu identifizieren als bei genetischen Erkrankungen. Krebszellen haben oft diverse genetische Profile innerhalb eines einzelnen Tumors, und normale Zellen können sich mischen, was die Analyse kompliziert.

Um die Zuverlässigkeit von T-NGS zu verbessern, bewerten Forscher die Nachweisgrenzen und die Spezifität bei der Identifizierung von Mutationen. Eine vorgeschlagene Lösung ist, Mischungen aus verschiedenen Zelllinien zu verwenden oder bekannte Mutationen hinzuzufügen, um als Referenzstandards für die Qualitätskontrolle zu dienen. Frühere Studien zeigten Inkonsistenzen bei der Variantenidentifikation, was darauf hinweist, dass weitere Untersuchungen zur Validierung von T-NGS notwendig sind.

#Bewertung der Sensitivität von T-NGS

Um die Zuverlässigkeit von T-NGS bei verschiedenen Anbietern zu bewerten, wurden Referenzstandard-DNAs erstellt. Diese beinhalteten eine Mischung aus DNA eines bestimmten Organismus und menschlichem Blut-DNA. Durch das Testen verschiedener Verhältnisse dieser Mischungen wollten Forscher herausfinden, wie sensitiv die Tests bei der Identifizierung von Varianten waren.

Sensitivität bezieht sich auf die Fähigkeit eines Tests, positive Ergebnisse korrekt zu identifizieren. In diesem Fall bedeutete das, Varianten in den Referenz-DNA-Proben zu erkennen. Die informativen Allele dienten als die Schlüsselmärker für die Testempfindlichkeit. Zum Beispiel waren einige Allele in einer Art von DNA null und hatten in der anderen eine Variante, was auf eine erkennbare Mutation hinwies.

Im Testprozess stellte sich heraus, dass unterschiedliche Mischungen von DNA verschiedene Sensitivitätsgrade erzeugten. Wenn die informativen Allele auf einen bestimmten Prozentsatz verdünnt wurden, änderte sich die Fähigkeit von T-NGS, sie zu erkennen. Wenn keine der Allele auf einem bestimmten Verdünnungsgrad erkannt wurde, zeigte das eine niedrigere Sensitivität für den Test an.

#Bewertung von falsch-negativen Fehlern

Falsch-negative Fehler können während der Bewertung der T-NGS-Ergebnisse auftreten. Verschiedene Firmen, die diese Tests herstellen, können unterschiedliche Ergebnisse bei der Identifizierung informativer Allele liefern. Eine Studie zeigte, dass einige Firmen weniger Varianten erkannten als erwartet, was auf hohe falsch-negative Raten hindeutete.

Um das weiter zu verstehen, untersuchten Forscher die von T-NGS aus mehreren Firmen generierten Daten. Sie schauten genau auf Allele, die voraussichtlich vorhanden sein sollten, aber nicht erkannt wurden. Diese Bewertung ermöglichte es ihnen, die falsch-negativen Raten für verschiedene Mischproben zu quantifizieren.

Zudem versäumten es einige Firmen konstant, informative Allele zu erkennen, was die Variabilität unter den T-NGS-Ergebnissen hervorhebt. Diese Inkonsistenz wirft Fragen zur Zuverlässigkeit dieser Tests im klinischen Bereich auf.

#Die Rolle der Bioinformatik in T-NGS

Bioinformatik bezieht sich auf die Nutzung von Software und Berechnungen zur Interpretation biologischer Daten. Im Zusammenhang mit T-NGS spielt Bioinformatik eine entscheidende Rolle bei der Analyse der Rohdaten, die von Sequenziermaschinen erzeugt werden. Verschiedene Firmen verwenden einzigartige bioinformatische Methoden, was zu Variationen in den Ergebnissen führen kann.

Um dies zu untersuchen, verglichen Forscher die Leistung verschiedener bioinformatischer Werkzeuge, die von T-NGS-Anbietern verwendet werden. In einigen Fällen führte alternative Software zu einer besseren Korrelation zwischen erwarteten Ergebnissen und tatsächlichen Ergebnissen. Dies war besonders der Fall, als spezifische Werkzeuge zur Datenanalyse eingesetzt wurden, wie das Dragen-System, das sich von internen Methoden einiger Firmen unterschied.

Durch diese Analyse wurde entdeckt, dass Diskrepanzen in den T-NGS-Ergebnissen von der bioinformatischen Verarbeitung und nicht von den Rohdaten während der Sequenzierung stammen könnten. Wenn die Analyse nicht genau durchgeführt wird, können selbst Daten von hoher Qualität zu irreführenden Ergebnissen führen.

#Bewertung der Spezifität von T-NGS

Ein weiterer wichtiger Aspekt von NGS ist seine Spezifität, also die Fähigkeit, negative Ergebnisse korrekt zu identifizieren. Praktisch bedeutet das, dass T-NGS eine Mutation nicht melden sollte, es sei denn, sie ist wirklich vorhanden.

Forscher suchten nach falsch-positiven Fehlern in den T-NGS-Ergebnissen, indem sie dieselben Referenzstandard-DNAs verwendeten, die für die Sensitivitätsprüfung genutzt wurden. Sie definierten falsch-positive Ergebnisse als jeden Fall, in dem eine Base gemeldet wurde, obwohl sie tatsächlich nicht in den DNA-Proben existierte.

Die Analyse zeigte, dass verschiedene Firmen erheblich unterschiedliche falsch-positive Raten hatten. Einige Methoden erzielten niedrige Fehlerquoten, während andere Mutationen erheblich überreported haben. Es wurde festgestellt, dass bestimmte Arten von Allelen, insbesondere die, die eigentlich nicht vorhanden sein sollten, häufig falsch-positive Fehler erzeugten.

Das Vorhandensein dieser falsch-positiven Ergebnisse wirft erhebliche Fragen zur Zuverlässigkeit der T-NGS-Ergebnisse auf. Effektive Bewertungsmethoden, die sich mit diesen Problemen befassen, sind entscheidend, um sicherzustellen, dass Patienten genaue Diagnosen und angemessene Behandlungen basierend auf ihren genetischen Profilen erhalten.

#Fehleranfällige Allele und ihre Auswirkungen

Forscher identifizierten auch spezifische Allele, die anfällig für falsch-positive Ergebnisse waren. Indem sie die Positionen dieser problematischen Allele über DNA-Mischungen analysierten, stellten sie fest, dass viele Fehler von denselben Orten stammten.

Diese Entdeckung deutete darauf hin, dass die Anwesenheit fehleranfälliger Allele die gesamten T-NGS-Ergebnisse verzerren könnte. Das Entfernen dieser aus den Analysen könnte die falsch-positiven Raten drastisch senken. Allerdings wurden Unterschiede zwischen verschiedenen Chargen festgestellt, was darauf hindeutet, dass selbst fehleranfällige Allele je nach experimentellen Bedingungen inkonsistent verhalten könnten.

Das Verstehen und Managen dieser fehleranfälligen Stellen wird wichtig sein, um die T-NGS-Methoden in der Zukunft zu verfeinern. Die fortlaufende Analyse und Identifizierung dieser Stellen könnte helfen, die Genauigkeit genetischer Tests zu verbessern.

#Der Einfluss analytischer Methoden auf die Ergebnisse

Die Methoden, die zur Analyse genetischer Daten verwendet werden, beeinflussen die Ergebnisse der T-NGS-Tests erheblich. Die bioinformatische Analysebedingungen, insbesondere die Verwendung unterschiedlicher Software, haben starken Einfluss auf sowohl Sensitivität als auch Spezifität.

In einigen Szenarien führte die Verwendung sensiblerer bioinformatischer Bedingungen dazu, dass eine grössere Anzahl von Varianten erkannt wurde. Allerdings kam dies auf Kosten einer erhöhten falsch-positiven Rate. Mit anderen Worten, obwohl es einfacher wurde, mehr Varianten zu identifizieren, waren viele davon falsch.

Daten von verschiedenen Firmen zeigten, dass eine Erhöhung der Sensitivität nicht immer mit einer verbesserten Spezifität korrelierte. In einigen Fällen führten Anpassungen, die zu einer leichten Erhöhung der Sensitivität führten, zu einem erheblichen Anstieg der Anzahl falsch identifizierter Mutationen.

Diese Erkenntnisse unterstreichen die Komplexität der NGS-Datenanalyse. Sie deuten darauf hin, dass ein Gleichgewicht zwischen Sensitivität und Spezifität gefunden werden muss, um sicherzustellen, dass die T-NGS-Ergebnisse sowohl genau als auch vorteilhaft für die klinische Praxis sind.

#Empfehlungen zur Verbesserung der T-NGS-Leistung

Angesichts der Variabilität in Sensitivität und Spezifität unter verschiedenen T-NGS-Anbietern können Empfehlungen zur Verbesserung der Leistung formuliert werden:

1. Standardisierung: Es ist wichtig, standardisierte Protokolle für T-NGS-Tests zu erstellen. Dies könnte helfen, die Variabilität zwischen den Laboren zu reduzieren und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu verbessern.

2. Validierung: Regelmässige Validierung der T-NGS-Ergebnisse unter Verwendung gut definierter Referenzstandards kann helfen, sowohl Sensitivität als auch Spezifität effektiv zu bewerten.

3. Bioinformatik-Training: Umfassendes Training in bioinformatischen Methoden für das Personal, das T-NGS-Daten analysiert, könnte helfen, Diskrepanzen bei der Variantenbestimmung zu verringern.

4. Forschung: Fortlaufende Forschung zu den Ursachen von falsch-negativen und falsch-positiven Ergebnissen wird wichtige Einblicke geben, die die Genauigkeit von T-NGS verbessern können.

5. Klinische Richtlinien: Die Etablierung klarer klinischer Richtlinien für die Interpretation von T-NGS-Ergebnissen würde den Gesundheitsfachkräften helfen, informierte Entscheidungen basierend auf den Testergebnissen zu treffen.

#Fazit

Nächste-Generation-Sequenzierung (NGS) ist ein wichtiges Werkzeug im Bereich der Genetik. Sie ermöglicht die schnelle Analyse grosser Mengen von DNA und hilft bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, einschliesslich Krebs. Allerdings gibt es Herausforderungen, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit dieser Tests zu gewährleisten.

Die Identifizierung der Einschränkungen von T-NGS ist entscheidend, besonders in Bezug auf falsch-positive und falsch-negative Raten. Die Variabilität, die bei Ergebnissen von verschiedenen Testanbietern zu beobachten ist, zeigt die Notwendigkeit an, Methoden kontinuierlich zu bewerten und zu verfeinern.

Durch die Entwicklung standardisierter Verfahren und verbesserter bioinformatischer Analysen kann das Feld die Zuverlässigkeit von T-NGS erhöhen. Letztendlich wird dies zu besseren Patientenergebnissen führen und zum Fortschritt der Präzisionsmedizin beitragen.