Fortschritte in der synthetischen Biologie mit CRISPR-Technologie

Synthetic Biology ist ein Bereich, der sich darauf konzentriert, neue biologische Teile und Systeme zu schaffen. Eines der Hauptziele ist es, programmierbare Entscheidungsfindungs-Schaltungen zu bauen, die spezifische Funktionen ausführen können. Diese Schaltungen funktionieren wie biologische Computer, die Informationen verarbeiten und auf verschiedene Signale reagieren.

Früher basierten die meisten synthetischen Schaltungen auf Proteinen, die Transkriptionsfaktoren genannt werden, um die Genaktivität zu steuern. Als Wissenschaftler jedoch komplexere Schaltungen erstellen wollten, stiessen sie auf Herausforderungen mit den Transkriptionsfaktoren. Jedes neue Protein musste getestet werden, um sicherzustellen, dass es gut mit den anderen Proteinen in der Schaltung funktionierte, was den Bau komplizierterer Systeme erschwerte. Ausserdem konnten hohe Mengen an Proteinen zu einem erhöhten Ressourcenverbrauch der Zellen führen, wo diese Schaltungen hergestellt wurden, was das Zellwachstum verlangsamte und Instabilität verursachte.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben Forscher begonnen, nach RNA-basierten Regulatoren zu suchen, insbesondere mit einem System namens CRISPR. CRISPR ist Teil eines natürlichen Abwehrmechanismus in Bakterien und bietet eine effektive Möglichkeit, die Genexpression mithilfe von RNA zu steuern. Eine Variante dieses Systems, bekannt als dCas9, kann auf fast jede DNA-Sequenz mit speziellen Leit-RNAs gerichtet werden. Wenn dCas9 auf genregionen gerichtet wird, kann es die Maschinen blockieren, die für das Lesen von Genen verantwortlich sind, und sie effektiv deaktivieren.

CRISPR hat mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Proteinsystemen. Das Design ist flexibel, was es einfacher macht, verschiedene Leit-RNAs zu erstellen, die in verschiedenen Situationen verwendet werden können. Diese Flexibilität ermöglicht es Wissenschaftlern, zu simulieren, wie sich verschiedene Schaltungen in unterschiedlichen Umgebungen verhalten könnten. Integrieren von anderen Proteinen in das CRISPR-System gibt den Forschern noch mehr Werkzeuge an die Hand, wenn es darum geht, Gene zu entwerfen. Zudem hat CRISPR einen geringeren Einfluss auf die Wirtszellen, da es weniger genetisches Material benötigt im Vergleich zu traditionellen proteingestützten Systemen.

#Die Herausforderungen bei der Verwendung von CRISPR

Trotz der vielversprechenden Eigenschaften von CRISPR kann die Überproduktion des dCas9-Proteins die normalen Zellfunktionen beeinträchtigen und zu Zellproblemen führen. Daher konzentrieren sich Forscher jetzt darauf, CRISPR-Systeme ausserhalb lebender Zellen zu entwickeln, in sogenannten zellfreien Systemen. Diese Systeme ermöglichen schnellere Tests von Gen-Schaltungen, den Bau synthetischer Zellen und das Entwerfen biologischer Wege ohne die Einschränkungen lebender Organismen.

Derzeit gibt es nur sehr wenige Beispiele für effektive Gen-Schaltungen, die mehrere Gene dynamisch in zellfreien Systemen steuern können. Um diese Lücke zu schliessen, nutzen Forscher eine gemeinsame Plattform, das T7 RNAP-System, das die Transkription in einer kontrollierten Umgebung simuliert. Dieses System ist bekannt für seine Konsistenz, da es normalerweise niedrigere Raten des Abbaus von Proteinen und RNA aufweist.

#Vereinfachung des Schaltungsdesigns

Synthetische Schaltungen zu erstellen, kann eine mühsame Aufgabe sein, da jedes Teil unabhängig entworfen werden muss. Inspiriert von der Funktionsweise elektronischer Schaltungen entwickeln Forscher eine neue Entwurfsmethode mit CRISPR. Diese Methode ermöglicht es mehreren Logikgattern, dieselben Ausgänge und Verarbeitungseinheiten zu teilen, während sie nur ihre Eingabemodule variieren. Durch das Ändern der Eingaben können die Ausgaben entsprechend angepasst werden.

Zum Beispiel wurden NOR- und NAND-Gatter entworfen, die ähnlich funktionieren und nur unterschiedliche Leit-RNAs erfordern, um verschiedene Ausgaben zu erzeugen. Nach Tests dieses Ansatzes konnten sie mehrstufige Logikgatter wie AND- und OR-Gatter entwickeln, die dieselben Ausgangsmodule verwenden. Dieser Ansatz reduziert die Komplexität und die Anforderungen des Schaltungsdesigns erheblich.

#Aufbau und Test synthetischer Schaltungen

In ihren Experimenten konstruierten die Forscher Plasmide, kleine DNA-Kreise, die für die Gentechnik verwendet werden. Sie verwendeten spezifische Sequenzen, um ihre Systeme zu erstellen und verwandelten sie in Bakterien, um die Schaltungen zu vermehren. Alle Sequenzen wurden sorgfältig geplant, um sicherzustellen, dass sie wie beabsichtigt funktionieren.

Um die Funktion der Schaltungen zu bewerten, richteten sie Transkriptionsreaktionen ein, bei denen sie DNA in RNA unter Verwendung des T7-Systems transkribierten. Verschiedene Reportergen wurden verwendet, um die Ausgabe zu visualisieren, damit die Forscher messen konnten, wie gut die Schaltungen funktionierten. Dann überprüften sie die Auswirkungen der Leit-RNAs auf diese Systeme, indem sie Fluoreszenzsignale beobachteten.

#Beobachtungen aus Experimenten

Die Ergebnisse ihrer Tests zeigten, wie effektiv die synthetischen Schaltungen funktionieren konnten. Sie entdeckten, dass verschiedene Leit-RNAs die Transkriptionslevels entweder erhöhen oder verringern konnten, abhängig davon, wie sie eingestellt waren. Besonders bemerkenswert war, dass bestimmte Leit-RNAs im Tandem verwendet werden konnten, um die Repression der Genexpression erheblich zu verbessern.

Darüber hinaus fanden die Forscher heraus, dass es möglich war, kaskadierende Signale zu erzeugen, bei denen eine Leit-RNA die Aktionen einer anderen beeinflussen konnte, was zu einer komplexeren Ausgabe führte. Diese kaskadierenden Fähigkeiten ermöglichen eine komplexe gestufte Logik innerhalb der Schaltungen.

#Fortschritte im Design von Logikgattern

Ein Durchbruch in ihrer Forschung war die Erkenntnis, dass CRISPR-Knoten mehrfach kaskadiert werden konnten, um fortgeschrittene Logikgatter zu erstellen. Sie entwarfen Schaltungen, die „AND“- und „OR“-Operationen integrieren konnten, indem sie verschiedene Leit-RNAs kombinierten. Dieser innovative Ansatz ermöglicht die Schaffung komplexerer Schaltungen, die mit einem einzelnen Satz von Komponenten mehrere Funktionen ausführen können.

#Erstellung von Logikgattern

Die Logikgatter, die sie erstellt haben, umfassten Konfigurationen, bei denen das Ergebnis von mehreren Eingaben abhing, die entweder alle vorhanden sein mussten (AND-Gatter) oder nur eine von ihnen ausreichte (OR-Gatter). Diese Gatter zeigten, dass sie effizient Signale verwalten und weiterleiten konnten, wobei der modulare Aspekt ihres Designs hervorgehoben wurde, der die Notwendigkeit zahlreicher einzigartiger Teile minimiert.

#Zukünftige Richtungen in der synthetischen Biologie

Der Fortschritt bei synthetischen Gen-Schaltungen mit CRISPR-Technologie bietet eine vielversprechende Zukunft für verschiedene Anwendungen. Obwohl bedeutende Fortschritte erzielt wurden, gibt es noch Herausforderungen zu bewältigen. Das Testen dieser Schaltungen innerhalb lebender Zellen ist der nächste Schritt, der ein tieferes Verständnis ihrer praktischen Anwendungen ermöglichen wird.

Ausserdem hält die modulare Natur ihrer Logikgatter das Potenzial bereit, hochkomplexe Systeme zu schaffen, die es den Forschern ermöglichen, zahlreiche Konfigurationen und Ausgaben zu erkunden. Diese Flexibilität kann zu innovativen Anwendungen in verschiedenen Bereichen führen, einschliesslich Medizin, Biotechnologie und Umweltwissenschaften.

Zusammenfassend zeigt die Forschung einen entscheidenden Schritt in Richtung des Aufbaus effizienter und vielseitiger synthetischer Gen-Schaltungen. Durch die Rationalisierung des Designprozesses und die Minimierung von Redundanz können Wissenschaftler sich darauf konzentrieren, fortschrittliche biologische Systeme zu schaffen, die unseren Ansatz für viele wissenschaftliche und praktische Herausforderungen in der Zukunft verändern könnten.