Fortschritte in den Proteinexpressions-Techniken

Proteine sind essentielle Teile aller lebenden Organismen. Sie spielen eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Prozessen. Zu verstehen, wie Proteine funktionieren und miteinander interagieren, ist wichtig für viele Wissenschaftsbereiche, inklusive Medizin und Genetik. Ein interessantes Merkmal von Proteinen ist, dass sie Komplexe mit anderen Proteinen bilden können. Das ist besonders wichtig, um herauszufinden, wie sie funktionieren und sich im Laufe der Zeit verändert haben.

In Zellen ist es oft nötig, die Aktionen und Interaktionen mehrerer Gene gleichzeitig zu studieren. Bei einfacheren Organismen wie Bakterien und Hefen können Wissenschaftler viele Gene leicht mithilfe spezifischer DNA-Sequenzen namens Promotoren exprimieren. Doch das kann bei komplexeren Organismen knifflig sein. Bei Tieren kann es ganz schön herausfordernd sein, mehrere Gene gleichzeitig zum Arbeiten zu bringen.

#Genexpressions-Techniken

Eine Möglichkeit, mehrere Gene auf einmal auszudrücken, ist die Nutzung einer speziellen Art von messenger RNA (MRNA). Diese mRNA kann die Informationen für mehrere Gene transportieren. Zum Beispiel ermöglicht eine Sequenz namens Internal Ribosome Entry Site (IRES) die Translation von zwei Genen aus einem einzigen mRNA-Strang. Allerdings führt die Verwendung von IRES oft zu einer geringeren Produktion des zweiten Gens im Vergleich zum ersten.

Eine andere fortschrittliche Methode nutzt kurze Peptide, die als 2A-Peptide bekannt sind. Diese Peptide helfen dabei, mehrere Proteine aus einem mRNA-Strang auszudrücken. Wenn diese Peptide produziert werden, stören sie das Ribosom so, dass das System bestimmte Abschnitte überspringt, was zur Produktion mehrerer Proteine führt. Diese Methode hat sich als wirksam erwiesen, um bis zu vier Gene gleichzeitig auszudrücken, jedoch nimmt die Effizienz mit jedem zusätzlichen Gen ab.

In Säugetierzellen kann ein System namens MultiLabel bis zu fünf Gene gleichzeitig exprimieren. Dieses System basiert auf einer Baculovirus-Expressionsmethode, die in bestimmten Mottenzelllinien verwendet wird.

#Alternatives Spleissen

Ein weiterer Weg, wie die Natur Vielfalt in Proteinen schafft, ist der Prozess des alternativen Spleissens. Dies ermöglicht es einem einzelnen Gen, mehrere Proteinformen zu erzeugen, indem bestimmte Segmente während der Erstellung von mRNA ein- oder ausgeschlossen werden. Ein bekanntes Beispiel für alternatives Spleissen ist das Drosophila Down-Syndrom Zelladhäsionsmolekül, oder Dscam. Das Dscam-Gen kann viele verschiedene Versionen des Proteins aufgrund seines komplexen Spleissmechanismus bilden.

Dscam enthält eine Reihe von Exons, die in einer sich gegenseitig ausschliessenden Weise ausgewählt werden können. Das bedeutet, dass während des Transkriptionsprozesses nur eine Version aus mehreren Optionen in die endgültige mRNA aufgenommen wird. Das schafft eine riesige Vielfalt an potenziellen Proteinprodukten.

#Das Poly-Transgen-Expressionssystem (PXGS)

Das Poly-Transgen-Expressionssystem (PXGS) ist eine neue Methode, die die Eigenschaft des alternativen Spleissens von Dscam nutzt. Indem die gesamte Spleissregion von Dscam in einen DNA-Vektor eingefügt wird, können Forscher ihn modifizieren, um jedes gewünschte Gen basierend auf den verfügbaren Spleissoptionen auszudrücken. Das ermöglicht es Wissenschaftlern, DSCAMS einzigartige Fähigkeit auszunutzen, viele verschiedene Proteine zu produzieren.

Mit diesem System können Forscher die Genexpression leicht manipulieren, um besser zu kontrollieren, wie und wann bestimmte Proteine in einer Zelle hergestellt werden. PXGS ermöglicht es, mehr als nur ein Gen gleichzeitig zu untersuchen.

#Verifizierung des Dscam-Spleissens im PXGS

Bevor PXGS verwendet werden konnte, war es wichtig zu überprüfen, ob Dscams einzigartiges Spleissen weiterhin korrekt funktioniert. Wissenschaftler führten Tests durch, indem sie Teile des Dscam-Gens in eine neue DNA-Konstruktion einfügten. Sie wollten sicherstellen, dass der Spleissprozess intakt blieb, als ein spezifischer Promotor verwendet wurde, der eine kontrollierte Expression ermöglicht. Die Ergebnisse bestätigten, dass die gewünschten Varianten von Dscam wie erwartet produziert wurden.

#Fluoreszierende Proteine und Genersatz

Forscher testeten auch die Fähigkeit, verschiedene Gene in das Dscam-Gerüst einzufügen. Indem sie spezifische Dscam-Exons durch Gene ersetzten, die fluoreszierende Proteine produzieren, konnten sie nachverfolgen, wo und wie diese Proteine in Zellen exprimiert werden. Die ersten Tests zeigten, dass sie nicht nur Exons durch fluoreszierende Gene ersetzen konnten, sondern dass das System immer noch richtig funktionierte, was darauf hindeutete, dass die spezifischen Sequenzen von Dscam nicht unbedingt für das Spleissen erforderlich waren.

#Mehrfarbige Expression in Zellen

Das PXGS-System ermöglicht die gleichzeitige Expression mehrerer fluoreszierender Proteine innerhalb eines einzigen Zelltyps. In den durchgeführten Experimenten war diese Anordnung in der Lage, erfolgreich vier verschiedene Farben fluoreszierender Proteine auszudrücken, um spezifische Zellen zu unterscheiden.

Bei der Anwendung dieser Methode auf neuronale Zellen stellten die Forscher fest, dass die Fluoreszenz sich über die vorgesehenen Neuronen verbreitete, was eine effektive Expression der verschiedenen Proteine zeigte. Allerdings fanden sie, dass die Helligkeit der einzelnen Farben geringer war als erwartet, da die Expression unter mehreren Proteinen verteilt war.

#Verwendung von PXGS über Neuronen hinaus

Da Dscam in verschiedenen Geweben exprimiert wird, nicht nur in neuronalen Zellen, wollten die Forscher PXGS auch in anderen Zelltypen testen. Sie entwickelten erfolgreich ein mehrfarbiges PXGS-Konstrukt, das die Expression mehrerer Fluorophore in verschiedenen Zellen ermöglichte. Indem sie die PXGS-Linien mit verschiedenen Gal4-Treibern kreuzten, konnten sie sowohl neuronale als auch nicht-neuronale Zellen im gesamten Organismus markieren.

#Funktionale Expression in der Gewebeorganisation

Ein wichtiger Teil der Verwendung von PXGS war zu testen, ob es grosse und funktionell bedeutende Gene exprimieren konnte. Die Forscher wählten eine Reihe von Zelloberflächenrezeptoren aus und integrierten sie in den PXGS-Rahmen, um sie spezifisch in sensorischen Neuronen falsch zu exprimieren. Dadurch konnten sie die Muster der neuronalen Verdrahtung und wie diese Rezeptoren in vivo miteinander interagierten, untersuchen.

Die Ergebnisse dieser Tests zeigten, dass die Fehl-Expression zu bemerkenswerten Veränderungen im Axonwachstum und in den Verzweigungsmustern führte. Diese Erkenntnisse gaben Einblicke, wie bestimmte Rezeptoren die Entwicklung und Struktur neuronaler Verbindungen beeinflussen.

#Fazit

Das Poly-Transgen-Expressionssystem (PXGS) bietet einen vielversprechenden neuen Ansatz zur Untersuchung der Genexpression und ihrer Auswirkungen auf biologische Systeme. Indem mehrere Gene gleichzeitig exprimiert werden, können Forscher tiefere Einblicke in Zellfunktionen, Proteininteraktionen und Entwicklungsprozesse in komplexen Organismen wie Fruchtfliegen gewinnen. Diese innovative Technologie hat das Potenzial, für verschiedene Anwendungen in der synthetischen Biologie und in Studien zur Genexpression über verschiedene Arten hinweg angepasst zu werden.