Melhorando as Técnicas de Imagem com Fitas de DNA Duplamente Marcadas

Fios de DNA marcados com fluoróforos são ferramentas importantes usadas em técnicas avançadas de microscopia. Esses fios minúsculos ajudam cientistas a ver coisas bem pequenas, como estruturas dentro das células, de forma mais clara. Quando combinados com métodos de imagem especiais, eles permitem imagens melhores de amostras biológicas.

#Técnicas Chave

Algumas das técnicas avançadas de microscopia que utilizam esses fios de DNA incluem:

• Microscopia de Localização de Moléculas Únicas (SMLM): Esse método ajuda a identificar onde moléculas individuais estão localizadas em uma amostra.
• Acúmulo de Pontos de DNA em Topografia Nanoscale (DNA-PAINT): Essa técnica usa fios curtos de DNA para criar imagens detalhadas de estruturas.
• Imagens de Flutuação Óptica de Super-Resolução (SOFI): Esse método fornece imagens de alta resolução analisando as flutuações da luz.
• Microscopia de Emissão Estimulada de Depleção (STED): Essa técnica oferece imagens de super-resolução usando um padrão de luz especial para desligar sinais de fundo.

Uma grande vantagem de usar esses fios de DNA é a capacidade de marcar múltiplos alvos de uma vez. Ao lavar e adicionar novamente diferentes fios marcados, os cientistas conseguem fazer imagens repetidas que ajudam a construir um quadro mais completo da amostra.

#Otimizando Imagens com Rótulos de DNA

Uma vantagem específica do DNA-PAINT é que permite que os cientistas meçam quanto de uma molécula específica está presente. Isso pode ser feito por meio de um processo chamado análise cinética. No entanto, usar rótulos de DNA com baixa afinidade pode trazer desafios. Esses rótulos precisam permanecer no meio de imagem durante os experimentos, o que pode aumentar o ruído de fundo e retardar a aquisição das imagens.

Para resolver esse problema, os cientistas introduziram fluoróforos quenched por FRET. Esses são tipos especiais de fluoróforos que, quando ligados a fios de DNA mais longos, podem reduzir o ruído de fundo. Recentemente, mostraram que usar fios de DNA em ambas as extremidades com fluoróforos idênticos pode resultar em auto-quenched. Isso significa que, quando os fios não estão ligados ao seu alvo, eles apresentam fluorescência mais baixa, levando a imagens mais nítidas.

#Caracterizando Novos Probes

Os cientistas projetaram vários novos fios de DNA marcados com fluoróforos, conhecidos como "fios de imagem". Usaram uma sequência de DNA comum e anexaram fluoróforos nas extremidades ou em apenas uma extremidade. Os fluoróforos escolhidos para este estudo foram Cy3B, silicon-rhodamine (SiR) e tetramethylrhodamine (TMR).

Caracterizaram esses fios examinando seu comportamento em solução quando estão sozinhos e quando se ligam a uma fita complementar. Observando suas propriedades de absorção e fluorescência, conseguiram ver quão eficazes eram esses novos fios.

#Observações

Quando os fios de imagem carregam dois fluoróforos, seus sinais fluorescentes mudam quando estão livres na solução versus quando estão ligados a um alvo. Especificamente, o sinal de fluorescência aumenta significativamente ao se ligar, indicando que os fios de dupla marcação são eficazes para imagem.

Eles também observaram mudanças na velocidade com que os fios se ligam e desligam de seus alvos, o que ajuda a determinar quanto tempo permanecem ligados durante a imagem.

#Usando na Microscopia STED

Os novos fios de imagem de dupla marcação foram testados na microscopia STED, onde se esperava que reduzissem a fluorescência de fundo vista em probes não ligados. Resultados anteriores indicaram que certas combinações de fios de dupla marcação reduziram efetivamente o ruído de fundo enquanto aumentavam o brilho dos probes ligados.

As imagens obtidas mostraram que, enquanto alguns fios apresentavam diminuição na intensidade fluorescente quando ligados, todos os fios de dupla marcação mostraram sinais de fundo mais baixos em comparação com seus equivalentes de marcação única. Isso resultou em uma melhor relação sinal-ruído para cada fio de dupla marcação usado na imagem.

Além disso, o aumento da relação sinal-ruído foi acompanhado por uma melhoria na resolução da imagem. Essa melhoria significa que os cientistas conseguiram distinguir detalhes menores em suas amostras.

#Imagem de Duas Cores

Utilizar fios de dupla marcação também permitiu que os cientistas realizassem imagem simultânea de duas cores. Isso significa que eles puderam visualizar duas estruturas diferentes em um único experimento, o que fornece informações ainda mais ricas sobre a biologia que está sendo estudada.

#Avançando a Microscopia DNA-PAINT

Os cientistas também aplicaram esses fios de imagem de dupla marcação na microscopia DNA-PAINT. Focaram em Cy3B e SiR, conhecidos por sua estabilidade e separação espectral. Ao comparar o desempenho de fios de marcação única e dupla em estruturas de origami de DNA, conseguiram avaliar quão bem esses fios se saíram juntos.

Os resultados indicaram que fios de dupla marcação ofereceram propriedades fluorescentes aprimoradas, levando a melhores resultados de imagem. O aumento na produção de fótons foi significativo, e os fios de dupla marcação proporcionaram resolução aprimorada.

#Visualizando Estruturas Biológicas

Usando os fios de imagem de dupla marcação, os cientistas visualizaram estruturas importantes como a proteína do complexo do poro nuclear Nup96. Compararam a saída de fótons dos fios de marcação única e dupla, confirmando que os fios de dupla marcação entregaram mais fótons e forneceram melhor detalhe na imagem.

#Conclusão

Essa pesquisa destaca como dímeros auto-quenched ligados a fios curtos de DNA podem melhorar significativamente a imagem em técnicas avançadas de microscopia. Ao utilizar probes de DNA de dupla marcação, os cientistas podem obter maiores razões sinal-para-fundo e melhor resolução de imagem.

As implicações desse trabalho vão além de uma única área da microscopia. Os princípios que governam esses fios de dupla marcação poderiam ser adaptados para outras técnicas, levando a mais avanços na imagem biológica. No fim das contas, essa pesquisa abre portas para observações mais precisas de processos e estruturas biológicas em nível molecular.