Engenharia de Enzimas pra Melhorar a Eficiência de Hidroxilação

Transformar ligações simples de carbono-hidrogênio (C-H) em grupos químicos mais úteis é um baita desafio na química sintética. Os cientistas tão buscando formas de fazer isso de forma eficiente, e a biocatalise, que usa proteínas naturais chamadas Enzimas, mostrou seu valor. As enzimas conseguem mirar essas ligações C-H com uma precisão incrível. Uma área bem legal é adicionar grupos hidroxila, que têm oxigênio e hidrogênio, às ligações C-H em certos compostos. Dois tipos de enzimas, conhecidas como P450s com heme e metaloenzimas de ferro não-heme, mostraram que conseguem fazer isso direitinho.

Pra deixar essas enzimas melhores no trabalho, os pesquisadores costumam usar técnicas de engenharia de proteínas. Esses métodos, como fazer mudanças com base na estrutura da enzima ou criar várias variantes e testá-las, podem melhorar o desempenho delas. Recentemente, o aprendizado de máquina (ML) começou a entrar nessa área. Usando ML, os cientistas podem analisar rapidamente várias mudanças possíveis na estrutura da enzima e prever quais podem fazê-la funcionar melhor. Embora o ML ajude muito, ele geralmente precisa de muitos dados pra ser eficaz, e coletar esses dados pode ser complicado.

Nesse trabalho, uma nova estratégia foi desenvolvida pra combinar ML com abordagens de design racional. O foco foi em uma enzima específica chamada dioxygenase de lisina (LDO), um tipo de enzima de ferro não-heme. Essa enzima pode adicionar um Grupo Hidroxila a uma parte específica da lisina, um aminoácido crucial pra muitos processos biológicos. A hidroxi-lisina, o composto resultante, é valiosa em várias indústrias, incluindo farmacêutica e polímeros.

#Projetando a Enzima

O objetivo principal era usar ML pra ajudar a desenhar versões melhores da LDO. Pra começar, os pesquisadores usaram uma abordagem específica de ML chamada MutCompute. Essa ferramenta foi treinada em várias estruturas de proteínas e ajuda a prever quais mudanças poderiam aumentar a atividade da enzima. Os pesquisadores usaram a estrutura cristalina da LDO, que mostra como a enzima parece em nível atômico, pra encontrar áreas onde mudanças poderiam ser feitas.

A ferramenta MutCompute identificou vários pontos na enzima onde os aminoácidos naturais não pareciam ser a melhor escolha pro ambiente. No total, 73 pontos de mudança potenciais foram encontrados. Depois de uma análise cuidadosa, 24 Mutações foram propostas com base nas previsões. Também foi importante evitar mudanças perto do centro de ferro da enzima, já que essas podem muitas vezes reduzir a atividade.

Pra validar essas mutações propostas, simulações de dinâmica molecular (MD) foram realizadas. Essas simulações ajudam a visualizar como a enzima e seu ambiente mudam quando determinadas mutações ocorrem. O objetivo era encontrar mutações que criassem interações mais fortes e melhorassem a estabilidade, mantendo a atividade da enzima.

Cinco mutações específicas foram escolhidas pra testes adicionais, e a profundidade na análise delas foi garantida observando como influenciaram o ambiente da enzima e a estabilidade geral.

#Purificando e Testando as Variantes

Uma vez que as mutações foram escolhidas, o próximo passo foi expressar as diferentes variantes da LDO e purificá-las pra estudo. O processo de purificação ajuda a coletar apenas a enzima, sem outros materiais indesejados. Curiosamente, a maioria das variantes recém-projetadas foi produzida em quantidades maiores que a versão original da LDO, indicando que essas mudanças ajudaram a enzima a ficar mais estável e solúvel no laboratório.

Uma das mutações diminuiu bastante o rendimento, sugerindo que pode ter um papel estrutural essencial pra enzima. As outras cinco pareciam melhorar o rendimento geral da proteína, e os pesquisadores até criaram um mutante combinado com todas as cinco mutações incluídas pra teste.

Ao avaliar as novas variantes, os pesquisadores mediram os pontos de fusão delas, que estão ligados à estabilidade. Os testes mostraram que enquanto a maioria das variantes tinham pontos de fusão semelhantes à LDO original, pelo menos uma variante mostrou estabilidade térmica melhorada. Esse tipo de teste é crucial porque enzimas estáveis são frequentemente mais eficazes.

#Avaliação da Atividade Catalítica

Depois de confirmar a estabilidade das variantes, o próximo passo foi avaliar a capacidade delas de realizar sua função prevista, que é adicionar grupos hidroxila à lisina. Isso foi feito usando um ensaio especializado. Nesses testes, as variantes da enzima foram misturadas com lisina e outros componentes necessários pra reação acontecer.

Assim que as reações foram concluídas, os cientistas precisaram separar as enzimas das misturas de reação pra observar os produtos formados. Eles marcaram os aminoácidos com um marcador químico específico que permite uma detecção fácil. Usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC), os pesquisadores observaram como a hidroxilação aconteceu.

Os resultados mostraram que cada variante projetada superou a LDO original na adição de grupos hidroxila à lisina. A variante de melhor desempenho, que incluía todas as cinco mutações, obteve um aumento notável na sua atividade em comparação com a enzima original, resultando em uma produção mais eficiente de hidroxi-lisina.

#Conclusão

Esse estudo destaca uma abordagem inovadora pra projetar enzimas de forma mais eficaz, fundindo técnicas de aprendizado de máquina com o design tradicional de proteínas. Ao focar na enzima dioxygenase de lisina, os pesquisadores identificaram e implementaram com sucesso mutações que melhoraram o desempenho da enzima.

O método permitiu que eles agilizassem o processo de design, reduzindo consideravelmente a quantidade de tentativa e erro normalmente necessária pra projetos desse tipo. As descobertas deles sugerem que essa estratégia poderia ser aplicada a outras enzimas da mesma família ou até mesmo aquelas que precisam de modificações mais complexas.

No geral, biocatalisadores desempenham um papel crucial na química sintética. Melhorar seu desempenho não só leva a processos químicos melhores, mas também promove práticas mais sustentáveis na indústria. Esse trabalho representa um passo empolgante rumo ao desenvolvimento de biocatalisadores mais eficientes e eficazes pra várias aplicações.