Usando o FlyVISTA pra Estudar o Sono em Moscas da Fruta

O cérebro tem a missão importante de captar informações tanto do corpo quanto do mundo externo pra ajudar a gente a agir da maneira certa. Pesquisadores estudam como os animais se comportam pra descobrir mais sobre esse processo. Novas tecnologias, especialmente em computadores e aprendizado de máquina, criaram um novo campo chamado etologia computacional. Esse campo foca em medir diferentes aspectos do comportamento animal automaticamente. A maioria desses estudos olhou para movimentos maiores durante períodos curtos.

Há mais de 150 anos, cientistas como Darwin e Tinbergen apontaram que até pequenos movimentos de partes do corpo ou mudanças na postura podem sinalizar sentimentos importantes como medo ou ansiedade, especialmente em animais como gatos e gaivotas. Esses pequenos movimentos, conhecidos como “microcomportamentos”, são muito importantes, mas difíceis de estudar. O desafio vem de detectar com precisão esses movimentos minúsculos e analisar imagens de alta qualidade por longos períodos.

Pra resolver isso, criamos o FlyVISTA, um sistema que usa aprendizado de máquina pra descrever e medir esses microcomportamentos em moscas-das-frutas, especificamente a Drosophila. Esse sistema usa vídeo em alta definição pra rastrear as moscas e também permite que os pesquisadores introduzam mudanças no ambiente delas usando lasers infravermelhos. O FlyVISTA utiliza um modelo de aprendizado de máquina pra rotular 35 partes do corpo das moscas. Depois de rotular, ele extrai comportamentos significativos desses rótulos ao longo do tempo.

Usamos o FlyVISTA pra estudar o sono em moscas-das-frutas. O sono é um comportamento básico encontrado em várias espécies, mas seu propósito ainda não é totalmente conhecido. A maioria das pesquisas sobre sono focou em mamíferos, mas estudar o sono em organismos mais simples, como as moscas-das-frutas, pode trazer insights valiosos. Analisar o sono das moscas pode nos ajudar a entender mais sobre as funções essenciais do sono e como isso evoluiu.

Tradicionalmente, os pesquisadores olhavam pro sono das moscas verificando períodos de inatividade que durassem mais de cinco minutos em um pequeno tubo. Contudo, esse método tem suas falhas. Ele pode perder movimentos curtos ou pequenos comportamentos que também fazem parte do sono. Além disso, manter as moscas em tubos estreitos pode causar estresse e afetar seu comportamento natural. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver um sistema que proporcionasse uma visão mais precisa do comportamento do sono em moscas-das-frutas se movendo livremente.

O sono é geralmente considerado um estado tranquilo. Diferentes microcomportamentos podem ser observados durante o sono. Por exemplo, em mamíferos, a falta de movimento ou certos movimentos rápidos dos olhos podem indicar sono profundo ou uma fase específica do sono. Estudos anteriores em abelhas e baratas mostraram movimentos pequenos semelhantes relacionados ao sono.

Com o FlyVISTA, encontramos uma variedade de microcomportamentos durante o sono das moscas-das-frutas, incluindo relaxamento da postura corporal, antenas caídas e movimentos rítmicos da probóscide. Também testamos como ativar dois circuitos neurais específicos envolvidos na promoção do sono afeta os microcomportamentos. Um circuito neural, conhecido como neurônios dFB, estava relacionado ao aumento de pequenos movimentos em vez de sono, enquanto outro, chamado neurônios R5, promovia extensões da probóscide seguidas por sono prolongado.

Curiosamente, identificamos um novo microcomportamento chamado “haltere switch”, que se refere a um movimento específico dos halteres. Halteres são órgãos pequenos nas moscas que funcionam de maneira semelhante ao sistema vestibular, que ajuda no equilíbrio nos mamíferos. Esse movimento de switch foi visto apenas durante momentos de tranquilidade e parecia marcar um nível mais profundo de sono.

#Imagem em Vídeo de Alta Resolução

Pra estudar esses comportamentos melhor, projetamos um setup que permite que as moscas se movam livremente e sejam gravadas em alta definição. Na nossa câmara, usamos uma visão lateral pra captar mais comportamento, já que pesquisas em outros insetos mostraram que mudanças importantes, como antenas abaixadas, são melhor vistas de lado. Esse setup nos permitiu ver a mosca em muito mais detalhe em comparação com outros métodos.

Pra rastrear os movimentos da mosca, usamos o DeepLabCut, uma ferramenta de software que ajuda a rotular e analisar partes do corpo usando um modelo treinado. Com essa ferramenta, rastreamos 35 pontos no corpo da mosca. Essas informações ajudam a entender como diferentes partes do corpo se movem em relação umas às outras ao longo do tempo.

Gravamos moscas individuais por longos períodos e examinamos sua atividade. Como esperado, notamos picos de movimento em certos horários do dia. À noite, as moscas mostraram longos períodos de inatividade, que associamos ao sono.

Durante esses períodos tranquilos, identificamos vários microcomportamentos. Depois de ficarem paradas, a postura do corpo da mosca relaxava sob a gravidade. As antenas caíam e movimentos rítmicos da probóscide também foram observados. Esses movimentos não eram exclusivos do sono, já que também ocorriam quando as moscas se limpavam ou se alimentavam.

Além disso, o comportamento do haltere switch, que envolve um movimento para baixo dos halteres, foi consistentemente observado durante momentos tranquilos. Esse comportamento em particular não havia sido notado em estudos anteriores e ilustra a variedade de microcomportamentos presentes durante o sono.

#Avaliando Limiares de Excitação

Um aspecto crítico na definição do sono é a ideia de um limiar de excitação aumentado. Pra testar isso, usamos um laser infravermelho especial que as moscas não conseguem ver. Ao aquecer gradualmente as moscas depois que elas estiveram inativas por um tempo, medimos quanta energia era necessária pra fazê-las se mover novamente. A resposta de cada mosca era única, então padronizamos as medições pra comparação.

Como esperado, encontramos que a quantidade de energia necessária pra perturbar as moscas variava ao longo da noite. O limiar era baixo em certos momentos e muito mais alto em outros períodos, sugerindo mudanças dinâmicas na profundidade do sono ao longo da noite.

A maioria dos estudos definiu o sono como períodos de inatividade que duram mais de cinco minutos. No entanto, nossas descobertas sugerem que períodos mais curtos de inatividade de três minutos são mais significativos e devem ser considerados como indicativos de sono. Foi observado que as moscas permaneciam próximas à sua comida durante esses momentos tranquilos, indicando que talvez se preparassem pra Dormir por perto.

Dado que nosso sistema é preciso e não envolve mover as moscas, conseguimos observar como seus microcomportamentos mudavam à medida que acordavam. Notamos que certos movimentos dos halteres e antenas frequentemente ocorriam pouco antes de as moscas se tornarem ativas novamente, sugerindo uma conexão entre esses pequenos movimentos e a transição do sono para a vigília.

#Ativando Circuitos Neurais e Análise de Comportamento

Pra estudar melhor os comportamentos do sono, manipulamos dois circuitos neurais conhecidos por influenciar o sono nas moscas-das-frutas. Um grupo conhecido de neurônios tem sido ligado à indução rápida de estados semelhantes ao sono, enquanto outro grupo está conectado à necessidade geral de sono.

Quando ativamos o primeiro grupo de neurônios, notamos uma diminuição nos movimentos, mas não no sono real. Em vez disso, vimos que as moscas exibiam mais micro-movimentos e comportamentos de limpeza, indicando que a ativação desses neurônios não promove sono.

No entanto, ativar o outro grupo de neurônios levou a um aumento nos movimentos de sondagem da probóscide durante a estimulação, seguidos por sono duradouro. Essa resposta indica que esses neurônios podem desempenhar um papel crucial na necessidade de sono e nos processos fisiológicos conectados a ele.

Nosso estudo com o FlyVISTA nos permitiu classificar diferentes comportamentos antes, durante e depois dessas ativações neurais. Os resultados mostraram comportamentos distintos ligados à ativação dos diferentes circuitos. Moscas cujos neurônios dFB foram ativados não entraram em um estado de sono, apesar de seus movimentos reduzidos, enquanto a ativação dos neurônios R5 levou a um aumento nas extensões da probóscide e a um estado de sono subsequente.

#Reconhecimento Automático de Comportamento

Um dos principais objetivos ao estudar comportamento animal é medi-lo automaticamente. Embora ferramentas como o DeepLabCut tenham facilitado o rotulamento de movimentos, extrair comportamentos significativos desses rótulos continua sendo um desafio, especialmente pra microcomportamentos sutis relacionados ao sono.

Pra resolver isso, desenvolvemos um sistema dentro do FlyVISTA que classifica comportamentos a partir de dados de vídeo não anotados baseados em um conjunto de exemplos anotados manualmente. O sistema atribui rótulos a cinco categorias comportamentais com base nos movimentos observados das moscas. No entanto, devido à sua natureza sutil e variada, classificar alguns comportamentos se mostrou mais difícil do que outros.

Através de nosso novo pipeline computacional, conseguimos distinguir os comportamentos das moscas com relativo sucesso. Por exemplo, nosso sistema identificou com precisão extensões da probóscide e comportamentos de alimentação mais do que outros. No entanto, descobrimos que o comportamento envolvendo movimentos de halteres era mais difícil de rastrear de forma confiável devido à sua sutileza e à dificuldade de observá-los consistentemente.

#Medindo o Sono com FlyVISTA

Usando o FlyVISTA, quantificamos o sono nas moscas-das-frutas com base em nossos critérios de observar períodos de inatividade que durassem mais de três minutos, excluindo limpeza e alimentação. Nossas descobertas mostraram que os padrões de sono em moscas se movendo livremente são mais consolidados do que o que foi relatado anteriormente em moscas amarradas.

Analisamos a quantidade e a duração do sono durante períodos específicos do dia. As moscas-fêmeas geralmente mantinham níveis de sono mais elevados durante a noite, enquanto as moscas-masculinas mostraram uma diminuição significativa no sono nas horas mais avançadas da noite.

Pra comparar nossos resultados com abordagens tradicionais, usamos outro método de medir o sono em pequenos tubos. Descobrimos que a quantidade de sono detectada usando métodos convencionais era maior do que a que observamos com o FlyVISTA. O uso do FlyVISTA levou a uma faixa mais estreita de duração do sono, indicando que as moscas provavelmente têm um comprimento padrão para os períodos de sono.

Depois de privar mecanicamente as moscas de sono, observamos um aumento na duração e na quantidade de sono em ambas as moscas masculinas e femininas, confirmando que nossa abordagem usando FlyVISTA é eficaz em medir o comportamento de sono.

#Comportamento de Extensão da Probóscide em Moscas-das-frutas

Nós também investigamos como os microcomportamentos das moscas-das-frutas, especificamente as extensões da probóscide, mudam ao longo do tempo e sob diferentes condições. Em circunstâncias normais, a frequência das extensões da probóscide permaneceu constante durante a noite, sem mostrar uma clara diminuição como havia sido relatado anteriormente.

Curiosamente, essas extensões ocorriam principalmente durante o sono, sugerindo uma forte conexão entre esse comportamento e os estados de sono. Depois da privação de sono, houve um aumento notável nas extensões da probóscide, indicando um controle homeostático.

Essa relação fornece insights sobre como esses comportamentos podem ser regulados de maneira diferente em diversas condições. Isso destaca a importância de estudar esses microcomportamentos pra entender plenamente a arquitetura do sono em moscas-das-frutas.

#Comportamento de Haltere Switch: Um Novo Insight

Por fim, focamos no comportamento do switch dos halteres, que mostra potencial pra definir estados de sono mais profundos nas moscas. Evidências sugerem que esses movimentos de halteres estão intimamente ligados ao sono, ocorrendo quase inteiramente durante períodos de sono.

Descobrimos que a primeira ocorrência dos switches de haltere geralmente acontece logo após o início do sono, indicando que esse comportamento pode sinalizar uma transição rapidamente para um sono mais profundo. Além disso, descobrimos que quando os halteres estavam na posição “para baixo”, as moscas tinham um limiar de excitação mais alto, sugerindo que esses switches indicam um estado de sono mais profundo.

Além disso, notamos vários tipos de movimentos de halteres, incluindo oscilações rítmicas que frequentemente eram acompanhadas por outros movimentos sutis no corpo da mosca. Esses movimentos rítmicos apontam pra ideia de que pode haver diferentes fases de sono que precisam de mais exploração.

#Conclusão

Em resumo, o uso do FlyVISTA abriu novas possibilidades pra estudar o sono e o comportamento em moscas-das-frutas. Combinando imagens de alta resolução e algoritmos avançados, conseguimos entender melhor a natureza complexa do sono e identificar comportamentos sutis que antes passaram despercebidos.

Nossas descobertas sobre microcomportamentos relacionados ao sono, o papel de diferentes circuitos neurais e a dinâmica do sono usando o FlyVISTA fornecem insights significativos sobre a natureza do sono em moscas-das-frutas. À medida que continuamos a aprimorar nossas técnicas e métodos de análise, iremos descobrir ainda mais sobre as complexas relações entre comportamento, sono e os mecanismos neurais subjacentes. Esse trabalho não só melhora nossa compreensão do comportamento das moscas-das-frutas, mas também contribui para discussões mais amplas sobre sono e comportamento em várias espécies.