Avançando a Genética Bacteriana com o Método mbPE
Nova técnica melhora a edição de genes em bactérias para várias aplicações.
Jan-Willem Veening, M. Rengifo-Gonzalez, M.-V. Mazzuoli, A. B. Janssen, A.-S. Rueff, X. Liu
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Índice
- Entendendo o CRISPR/Cas9
- O Desafio com Algumas Bactérias
- Edição Primária: Um Novo Método
- Apresentando a Edição Primária de Faça ou Quebre (mbPE)
- Como o mbPE Funciona
- Eficiência do mbPE em Bactérias
- Projetando as Ferramentas Certas
- Testando Múltiplas Mudanças
- Aplicações na Vida Real
- Ferramentas pra Engenharia Genética
- Explorando Interações Genéticas
- Perspectivas Futuras com o mbPE
- Conclusão
- Fonte original
- Ligações de referência
Bactérias são coisinhas vivas minúsculas que estão em todo lugar. Elas têm um papel importante nas nossas vidas, tanto bom quanto ruim. Algumas bactérias ajudam a gente a digerir comida, enquanto outras podem nos deixar doentes. Os cientistas estão tentando mudar a composição genética das bactérias pra entender melhor e usá-las pra coisas boas, como produzir remédios ou quebrar resíduos. Um dos métodos legais que foi desenvolvido pra mudar o DNA das bactérias se chama CRISPR/Cas9.
Entendendo o CRISPR/Cas9
O CRISPR/Cas9 é uma ferramenta que os cientistas usam pra editar genes. Funciona como uma tesoura que corta o DNA em pontos específicos. Depois que o DNA é cortado, a bactéria pode se consertar sozinha, ou os cientistas podem colocar novos pedaços de DNA pra mudar o código genético. Esse método é útil, mas pode ser demorado e complicado, especialmente com alguns tipos de bactérias que são difíceis de mudar.
O Desafio com Algumas Bactérias
Algumas bactérias, como Staphylococcus aureus e espécies de Clostridium, são difíceis de alterar usando métodos normais. Os cientistas frequentemente têm que passar por muitos passos pra conseguir as mudanças desejadas, e isso pode levar um tempão. Existem outros métodos que podem funcionar melhor, mas ainda não foram testados em bactérias difíceis de trabalhar.
Edição Primária: Um Novo Método
Recentemente, foi desenvolvido um novo método chamado edição primária. Diferente do CRISPR/Cas9, que corta as duas fitas do DNA, a edição primária usa uma abordagem diferente. Ela faz um único corte, o que ajuda a evitar alguns erros que podem acontecer quando o DNA se repara. Esse método mostrou promessa em outras formas de vida, como plantas e animais, mas os pesquisadores querem ver se ele pode ser útil pra bactérias também.
Apresentando a Edição Primária de Faça ou Quebre (mbPE)
Neste estudo, foi introduzido um novo método chamado edição primária de faça ou quebre (mbPE) pra bactéria Streptococcus pneumoniae, que pode causar infecções em humanos. Esse método combina a capacidade de corte do CRISPR com as vantagens da edição primária pra fazer mudanças genéticas de forma mais eficiente. Com o mbPE, os cientistas tentaram fazer mudanças nos genes bacterianos de forma rápida e precisa.
Como o mbPE Funciona
O mbPE usa uma enzima especial que consegue cortar o DNA e está ligada a outra parte que ajuda a inserir novas informações genéticas. Assim, quando o DNA é cortado, a bactéria pode pegar a nova informação e usá-la pra se mudar. A parte legal é que esse método permite que os pesquisadores escolham quais bactérias foram modificadas com sucesso. As bactérias que forem mudadas corretamente vão sobreviver, enquanto as outras vão morrer porque não conseguem consertar o corte no DNA delas.
Eficiência do mbPE em Bactérias
Os pesquisadores testaram o método mbPE em S. Pneumoniae. Eles conseguiram fazer pequenas mudanças (mutações pontuais) e adicionar ou remover pedaços de DNA de forma eficiente. Eles descobriram que, quando usaram as ferramentas certas, cerca de 93% das bactérias modificadas tinham as mudanças desejadas.
Projetando as Ferramentas Certas
Pra o mbPE funcionar bem, os pesquisadores precisaram projetar ferramentas específicas chamadas PegRNAs. Os pegRNAs guiam o processo de edição e ajudam a atingir os pontos certos no DNA. O comprimento e a estrutura desses pegRNAs são essenciais pro sucesso da edição. Os pesquisadores descobriram os melhores comprimentos pros pegRNAs, o que melhorou a eficiência da edição.
Testando Múltiplas Mudanças
Uma possibilidade empolgante com o mbPE é que ele pode ajudar os cientistas a fazer várias mudanças no DNA bacteriano ao mesmo tempo. Os pesquisadores queriam ver se seu método poderia introduzir diferentes tipos de mudanças, como mutações pontuais, inserções e deleções, tudo de uma vez. Eles descobriram que, usando seu método, conseguiam fazer essas mudanças múltiplas de forma eficaz.
Aplicações na Vida Real
Com o método mbPE sendo tão eficiente, os cientistas veem muitas aplicações potenciais. Por exemplo, eles poderiam usá-lo pra estudar as funções de diferentes genes em bactérias, examinar como as bactérias reagem a antibióticos ou até criar cepas de bactérias que produzam compostos úteis.
Ferramentas pra Engenharia Genética
Ferramentas de engenharia genética como o mbPE podem mudar como trabalhamos com bactérias. A capacidade de fazer mudanças precisas pode ajudar os pesquisadores a criar bactérias que sejam mais úteis pra tarefas como quebrar poluentes, produzir biocombustíveis ou fazer vacinas.
Explorando Interações Genéticas
Outra aplicação poderia incluir estudar como diferentes bactérias interagem entre si ou com células humanas. Por exemplo, os pesquisadores poderiam marcar certos genes com marcadores que ajudam a rastrear onde eles vão e o que fazem dentro das células bacterianas. Isso pode revelar informações importantes sobre como as bactérias funcionam e como podem ser controladas.
Perspectivas Futuras com o mbPE
A flexibilidade e eficiência do mbPE sugerem que ele poderia ser aplicado não só ao S. pneumoniae, mas também a outros tipos de bactérias. Os pesquisadores querem expandir esse método pra bactérias que são mais difíceis de trabalhar ou aquelas que têm papéis importantes na saúde e doença humanas.
Conclusão
Em resumo, o desenvolvimento da edição primária de faça ou quebre (mbPE) abre possibilidades empolgantes pra engenharia genética em bactérias. Ao tornar o processo mais rápido e eficiente, os pesquisadores esperam ganhar uma compreensão mais profunda das funções bacterianas e, no final, usar esses insights pra aplicações benéficas na medicina, biotecnologia e ciência ambiental.
À medida que os cientistas continuam a refinar e melhorar o mbPE e ferramentas relacionadas, o potencial pra inovações em genética bacteriana e suas aplicações só tende a crescer.
Fonte original
Título: Make-or-break prime editing for bacterial genome engineering
Resumo: CRISPR-Cas9 has revolutionized genome engineering by allowing precise introductions of DNA double-strand breaks (DSBs). However, genome engineering in bacteria is still a complex, multi-step process requiring a donor DNA template for repair of DSBs. Prime editing circumvents this need as the repair template is indirectly provided within the prime editing guide RNA (pegRNA). Here, we developed make-or-break Prime Editing (mbPE) that allows for precise and effective genetic engineering in the opportunistic human pathogen Streptococcus pneumoniae. In contrast to traditional prime editing in which a nicking Cas9 is employed, mbPE harnesses wild type Cas9 in combination with a pegRNA that destroys the seed region or protospacer adjacent motif. Since most bacteria poorly perform template-independent end joining, correctly genome-edited clones are selectively enriched during mbPE. We show that mbPE is RecA-independent and can be used to introduce point mutations, deletions and targeted insertions, including protein tags such as a split luciferase, at selection efficiencies of over 93%. mbPE enables sequential genome editing, is scalable, and can be used to generate pools of mutants in a high-throughput manner. The mbPE system and pegRNA design guidelines described here will ameliorate future bacterial genome editing endeavors.
Autores: Jan-Willem Veening, M. Rengifo-Gonzalez, M.-V. Mazzuoli, A. B. Janssen, A.-S. Rueff, X. Liu
Última atualização: 2024-12-13 00:00:00
Idioma: English
Fonte URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.27.601116
Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.27.601116.full.pdf
Licença: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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