ショウジョウバエのタンパク質相互作用の研究

タンパク質は生物にとって重要な分子だよ。これはアミノ酸という小さな単位の鎖からできていて、各種のタンパク質は体の中で特定の役割を果たしてるんだ。組織を作ったり、化学反応を早めたりね。ほとんどの生物には遺伝子にコードされた10,000〜20,000種類の異なるタンパク質がある。これらのタンパク質は生命に必要なほとんどの化学反応を行ってるんだ。

タンパク質が機能する主要な方法の一つは、互いに相互作用すること。タンパク質が集まると、互いの機能を強化したり抑えたりする複合体を作るんだ。これらの相互作用は細胞が正常に機能するために重要なんだよ。例えば、タンパク質は必要な場所に誘導されたり、タンパク質複合体の動きを変えたりすることができる。

細胞の混雑した環境では、タンパク質は互いにだけでなく、他のタイプの分子ともやり取りすることが多い。だから、タンパク質の相互作用を研究することは、その役割を理解するためにすごく重要なんだ。

#タンパク質相互作用の分析方法

科学者たちは、タンパク質の相互作用を大規模に研究するためのいくつかの方法を開発してきたよ。一つの方法はTandem Affinity Purification Mass Spectrometry（TAP-MS）っていうもので、酵母のタンパク質を研究するのに使われてる。もう一つの方法は二重ハイブリッドスクリーニングで、これはヒトのタンパク質に関する包括的なデータを提供してる。

多くの研究が行われてきたけど、異なる生物でのタンパク質の相互作用についてはまだまだ不明な点が多いんだ。タンパク質間の相互作用は、その三次元の形状に大きく影響される。これらの形状は、タンパク質がどのようにお互いに結合するかを決定するんだよ。

これらの相互作用を分析するためには、タンパク質の3D構造に関する情報が必要なんだ。構造はX線結晶構造解析や核磁気共鳴（NMR）などの実験的方法を使って決定できるけど、これらの技術は時間と労力がかかることが多い。最近、AlphaFold2というコンピュータプログラムが導入されて、アミノ酸配列からタンパク質の3D構造を予測できるようになった。このツールは計算科学と実験科学の両方で価値があるものになってるよ。

#ショウジョウバエとヌアージュに焦点を当てる

この研究では、果物バエ、科学的にはDrosophila melanogasterという特定のタンパク質のセットに焦点を当てたよ。これらのタンパク質はヌアージュという特別な細胞小器官に関連していて、これはpiRNAと呼ばれる特定の小さなRNA分子を生成するのに重要なんだ。piRNAは、正常な細胞機能を妨げる不要な遺伝要素を抑制するために重要なんだよ。

ヌアージュは生殖細胞に見られる独特な構造で、特定の機能部品を持ついろんなタンパク質を含んでる。piRNA関連のタンパク質に加えて、翻訳を調整するのを助ける他のタンパク質もヌアージュに集まってる。

以前の研究では、ヌアージュにあるいくつかのタンパク質の位置が互いの相互作用によって影響を受けることが示されたんだ。でも、これらのタンパク質がどのように相互作用し、自己組織化するのかの詳細はまだわからない。

これらの相互作用についてもっと知るために、AlphaFold2プログラムを使ってヌアージュとpiRNA生成に関連する20のタンパク質を研究した。培養細胞で相互作用を確認するためにペアをテストして、いくつかの予測された相互作用を確認したよ。特に、Spindle-E（Spn-E）とSquash（Squ）という2つのタンパク質の間に新しい相互作用があることをco-immunoprecipitationアッセイを用いて発見した。さらに、予測された相互作用を妨げるSquミュータントをテストして、私たちの発見の有効性を確認したんだ。

#タンパク質の特性概要

私たちが研究したタンパク質は、ヌアージュの非膜構造を形成するのに関与していることが知られてる。以前の研究は、ヌアージュとミトコンドリアにあるさまざまなタンパク質間のつながりを示していた。いくつかのタンパク質は、細胞のメッセンジャーRNAを管理するのに関与する処理小器官とも相互作用している。ヌアージュ内でのこれらのタンパク質の関係や役割は、まだ研究が続けられているところなんだ。

私たちはヌアージュに局在するか、piRNA生成に関与する20のタンパク質に特に注目したよ。これらのタンパク質のサイズはさまざまで、構造もよく形成されたものから大きく無秩序なものまでいろいろだった。一部のタンパク質には、特定の残基に結合する特別なドメイン、いわゆるTudorや拡張Tudorドメインが含まれてる。私たちの分析には、piRNA処理に不可欠なRNAヘリカーゼもいくつか含めたよ。

#AlphaFold2を使って相互作用を予測

AlphaFold2を使って、これらのタンパク質がどのように相互作用するかを予測したんだ。関与する20のタンパク質があるから、400ペアの潜在的な相互作用を生成した。AlphaFold2プログラムは、各ペア間の相互作用の可能性をその配列に基づいて予測したよ。

各ペアについて、5つの異なる構造モデルが生成されて、その中で最も高い信頼スコアを持つものが選ばれた。このスコアは、全体的な構造とタンパク質が接触する界面を評価する評価の組み合わせなんだ。信頼スコアの閾値を0.6に設定して、これ以上のスコアを持つタンパク質ペアを複合体形成の候補と見なしたよ。

この分析から、13ペアを特定して、そのうち7ペアは既知の相互作用があったことが確認されて、AlphaFold2の有効性が裏付けられた。最高スコアのペアは、すでに構造が知られているZucというタンパク質のホモ二量体だったんだ。

#新しいタンパク質相互作用

私たちが発見した新しい相互作用の中で、これまで直接相互作用が報告されていなかったタンパク質の間での相互作用が3つあったよ。これには以下が含まれる：

• Me31BとTral
• BoYbとVret
• Mei-W68とSqu

これらのペアについて、培養細胞を用いて相互作用を確認するための追加実験を行った。いくつかのペアは強い相互作用を示した一方で、他のペアは確認が難しい弱い結びつきがあったんだ。

#特定の相互作用の研究：Spn-EとSqu

Spn-EとSquの相互作用に焦点を当ててみたところ、両方のタンパク質がpiRNAの生成に重要な役割を果たしていることがわかったよ。Spn-Eにはその機能を定義するいくつかのドメインがある。予測された二量体構造では、Squの一部がSpn-Eの溝にフィットすることが示されて、正確な結合相互作用を示唆してるんだ。

私たちは、Spn-EとSquの相互作用を安定させる塩橋（salt bridges）と呼ばれる重要な接続を探してみた。これを実験的に検証するために、これらの塩橋を変化させるSquのミュータントを作成して、その結合能力をテストした。結果として、いくつかの変異が結合強度を低下させ、四重変異体ではSpn-Eに結合できないことが完全に失われたんだ。

#卵巣での局在研究

相互作用をさらに調べるために、Drosophilaの卵巣でSpn-EとSquが相互作用するかどうかを見てみたよ。抗体を使ってそれらの存在を検出して、卵巣のライセート中にSquタンパク質を示す特定のバンドを見つけた。免疫染色を通じて、SquとSpn-Eがヌアージュ内に一緒に現れてるのを観察して、彼らの直接的な相互作用を支持したんだ。

#他の相互作用のスクリーニング

私たちは、ショウジョウバエの卵形成に関与するタンパク質を含む研究を広げたよ。この段階は、 viableな卵を生成するのに重要なんだ。AlphaFold2を使って1,290ペアを予測して、よく相互作用する可能性のある18ペアに絞り込んだ。これらの相互作用のうち3つをco-immunoprecipitationアッセイで検証した。

注目すべきは、確認されたペアの一つであるMei-W68とSquの相互作用が、DNA損傷修復経路に関連していることを示唆していることだ。他の確認されたペアには、CSN3とSqu、Pka-C1とTejが含まれていて、これらの結果は生殖細胞発生における複雑な調整ネットワークを示唆しているね。

#Piwi相互作用のための全ショウジョウバエタンパク質のスクリーニング

Piwiはさまざまな細胞プロセスに重要だから、Drosophilaの全てのタンパク質をスクリーニングしてPiwiとの潜在的な相互作用を見つけたよ。ほとんどのペアは相互作用の可能性が低かったけど、約1.5%のペアは有望な結果を示したんだ。

高スコアの候補の中には、いくつかのpiRNA関連タンパク質と、いくつかの細胞代謝酵素が含まれていたよ。私たちはPiwiと2つの候補―TwfとBrnの間の相互作用を確認した。Twfとの結合は見つからなかったけど、Brnとの間に重要な相互作用があったことがわかって、Piwiによって調整されるプロセスの関連を示してるね。

#結論

この研究では、ショウジョウバエにおけるヌアージュとpiRNA生成の構成要素に特に焦点を当てて、さまざまな潜在的なタンパク質相互作用を特定したよ。いくつかの相互作用は知られていたけど、他のものは新しくて、AlphaFold2を使うことが生物学的研究において役立つことを示しているんだ。

これらの相互作用を理解することで、細胞機能の基礎メカニズムや、健康や疾患の状態における影響を理解するのに役立つかもしれない。生理的条件下でのこれらの相互作用の生物学的な重要性を確認するためには、さらなる実験が必要なんだ、とくにストレスや病気の文脈においてね。

#材料と方法

必要な抗体を生成するために、ターゲットタンパク質を細菌細胞で発現させて精製したよ。さまざまな抗体を使ってウエスタンブロット分析や他のテストを行い、タンパク質間の相互作用を確認したんだ。

AlphaFold2は、タンパク質がどのように相互作用するかを、配列を分析することによって予測するのに使われた。タンパク質の構造は、その形状や接続性に関する洞察を提供するソフトウェアツールを使って視覚化したよ。

ショウジョウバエのストックは制御された条件下で維持され、さまざまなco-immunoprecipitationおよび局在アッセイを実施して、私たちの予測の検証を行ったんだ。これらの方法で、タンパク質の相互作用やそれらの生物学的プロセスにおける重要性に関する substantialなデータを集めることができた。

全体として、この研究はタンパク質の相互作用やそれらの細胞機能における役割、特にショウジョウバエの生殖細胞発生の文脈における理解を深めるのに貢献してるよ。