効率的な顕微鏡サンプル準備と分析方法

顕微鏡の画像は生物学的サンプルについてたくさんの重要な情報を提供してくれます。ただ、科学者が論文を書くとき、サンプルごとに多くの画像を載せるスペースが足りないことがよくあります。だから、通常はデータを代表する1枚の写真だけを載せることが多くて、それがただの1つの細胞を示していることもあります。この制限を乗り越えるために、科学者は統計分析を使ってサンプル間の違いについて情報を共有することができます。

顕微鏡の画像を分析する際、科学者は細胞内の異なる分子の位置に注目することが多いです。場合によっては、この分析は手作業で行われていて、つまり人が画像を見て、何をどう測るかを決めることになります。この手作業はデータに誤りやバイアスを引き起こす可能性があります。

顕微鏡で見るためのサンプルを準備するには、科学者は細胞をガラススライドにくっつけるためにコンカナバリンAやポリ-L-リジンのような物質を使うことがあります。でも、私たちは細胞をガラススライドに置いて、小さなアガロースゲルのブロックで覆うという別の方法を開発しました。このアガロースゲルは、細胞が通常育てられている液体と同じものから作られていて、細胞を自然な環境に保つのに役立ちます。この方法では、細胞が他の方法でストレスを受けずにガラス表面に座っていることができます。

細胞は単層に配置される傾向があり、写真を撮るのが簡単で、コンピューターのストレージスペースも節約できます。アガロースゲルは、実験中に小さな化学物質を追加することも可能で、時間経過の研究には便利です。長時間の実験中に水が蒸発しないように、別のガラスをセットの上に置きます。

この方法は、特別なコーティングや高価な機械を必要とする従来の方法に代わる便利な選択肢です。

#サンプル準備に必要な機器

#顕微鏡サンプルホルダー

顕微鏡スライド用のカスタムサンプルホルダーを作りました。このホルダーは3Dプリンターを使って作れるよ。

#スパチュラ

古いウエスタンブロッティング用のフィルムからシンプルなスパチュラを作ることができます。

#サンプルの準備手順

1. 平らな面にきれいなガラススライドを置く。
2. ピペットを使ってスライドに少量の細胞懸濁液をのせる。
3. アガロースゲルの小さな塊を取り、それを手作りのスパチュラを使って細胞懸濁液の上に置く。
4. アガロースの塊をひっくり返して、ホルダーにうまく収まるようにする。
5. テープを使ってスライドをホルダーに固定する。
6. タイムラプス実験を行う場合は、ホルダーをひっくり返して、もう1枚のガラススライドを上にテープで貼ってすべてを密閉する。

#自動分析プロトコル

今話している分析は、ソフトウェアを使って画像内の細胞を自動的に特定して測定するものです。このプロセスは効率的で、人が関与する必要がないので、バイアスを避けるのに役立ちます。

画像を撮影したら、バッチ処理できるので、複数の画像を一度に分析できます。画像が処理された後、結果は簡単に抽出できます。分析はコマンドラインスクリプトやスプレッドシートソフトウェアを使って行うことができます。

#材料と試薬

#生物材料

この方法は特定のタイプの酵母細胞用に設計されていますが、多くのタイプの細胞でも使えます。

• ゲルを作るためのアガロース。
• 細胞周囲の条件を維持するためのさまざまな緩衝液。
• 蒸留水。

#実験室用品

• さまざまなサイズのペトリ皿。
• 細胞を育てるためのファルコンチューブ。
• 小容量用のマイクロセントリフュージュチューブ。
• 液体を移動するためのピペットと互換性のある先端。
• 精密液体処理用の注射器とフィルター。
• アガロースを切るためのメス。
• サンプルを見るための顕微鏡用カバーガラス。
• 顕微鏡レンズを掃除するための用品。
• サンプル固定用のテープ。

#必要な機器

• サンプルを見るための顕微鏡。
• アガロースを準備するための電子レンジ。
• サンプルを混ぜるためのボルテックスミキサー。
• ソフトウェアを実行し、データを整理するためのコンピュータ。

#顕微鏡観察用の酵母培養の準備

1. 適切な環境で酵母細胞を育てる。
2. 培養物をファルコンチューブまたは小さなチューブに移す。
3. セントリフュージュして、細胞を底に集める。
4. 上にある液体を取り除き、細胞だけにして、細胞を再び懸濁液に混ぜる。
5. 少量を取り、ガラススライドに置く。
6. 前述の通り、アガロースゲルで覆い、ホルダーに密閉する。

#顕微鏡画像の取得

画像を撮るときは、正確な結果を得るために特定のガイドラインに従うことが非常に重要です。考慮すべき重要なポイントは以下の通りです：

• 画像がオーバーエクスポーズされないように、これは誤った読み取りにつながる可能性があります。
• 画像を撮る際は明るさとコントラストを適切に設定する。
• 画像で使用されている蛍光タグが漂白しないようにする。
• 画像品質に影響を与えるバックグラウンドノイズをチェックする。
• 異なる蛍光マーカーからの信号が重ならないようにする。
• 異なるサンプル間でのイメージング設定は一貫性を持たせる。
• 適切な調整なしに異なる日の画像を比較しない。

#画像の分析

画像を撮ったら、大量のデータを処理できるソフトウェアを使って分析できます。この分析では、各細胞のサイズや蛍光強度など、さまざまな測定値を提供します。また、細胞内の特定の領域の信号強度が高いところをチェックすることもできます。

すべてがスムーズに進むように、画像は論理的にフォルダーに整理され、それぞれのフォルダーは一貫して名前を付ける必要があります。これにより、分析中の混乱を防ぐことができます。

#分析のための設定

分析を始める前に、画像をソフトウェアが読み取れる形式に変換する必要があります。通常、画像をTIFFファイルとしてエクスポートすることが含まれます。私たちが使うソフトウェアは、タイムラプス画像で発生するドリフトを修正することもできます。

画像をエクスポートしたら、バッチ処理で分析できます。画像から期待されるものに基づいてパラメーターを選択します。例えば、細胞の平均サイズなどです。分析は個々の細胞を特定し、それらの特性を報告します。

#セグメンテーションの確認

分析プロセスが終わったら、結果の正確性を確認する必要があります。これには、結果の一部を視覚的にチェックして、すべてが正しく見えるかを確認することが含まれるかもしれません。もし細胞が見逃されたり、不正確にマークされていたら、手動で調整できます。

確認が終わったら、結果はさらなる統計分析の準備ができます。

#定量化の実行

ROI（関心領域）が確認されたら、定量化を実行できます。このプロセスでは、確認されたROIから各細胞のさまざまな測定値を抽出します。以下のことを行ってください：

• 分析したいデータが含まれるフォルダーを指定する。
• 注目するチャンネルを選択する（画像で使用される異なる色など）。
• 細胞サイズとしてカウントされる限界を設定する。
• 余分なチェックを実施する必要があるかどうかを決める（例えば、死細胞を探すなど）。

準備ができたら、分析を実行して結果が生成されるのを待ちます。ソフトウェアがデータを結果表にまとめて、後で簡単に参照できるようになります。

#データの抽出とプロット

定量化の後、データは分析のためにさまざまな方法で整理できます。これには平均値の計算や異なる条件の比較が含まれます。結果はグラフ作成ソフトウェアや他のデータ分析ツールで使用するためにエクスポートできます。

#Bashスクリプトの使用

コマンドラインツールに慣れている人は、提供されたスクリプトを使用して自動的に結果をフィルタリングし処理できます。これらのスクリプトは、条件や処置のような異なる変数に基づいてデータをさらに整理するのに役立ちます。

#グラフ作成ソフトウェアの使用

グラフ作成ソフトウェアを使用する際、結果をインポートしてプロットのために整理できます。これには、焦点を当てたいデータの部分を選択し、統計分析のために処理することが含まれます。

#ExcelやCalcの使用

スプレッドシートソフトウェアを使用して結果を手動で分析することもできます。これには特定のデータポイントをフィルタリングし、実験デザインに基づいて平均値を計算することが含まれるかもしれません。

#結論

この顕微鏡サンプル準備と分析のアプローチは、データを扱うより一貫性があり効率的な方法を提供します。自動分析と注意深いサンプル準備を統合することで、科学者は発見をより良く伝えることができます。この方法は、データ収集における人的エラーを減らしつつ、より包括的な洞察を可能にします。

技術とソフトウェアの進歩が続く中、生物サンプルの分析はますますスムーズになり、研究者が複雑な生物学的システムをよりよく理解するためのツールを提供しています。