新しい方法が学習におけるタンパク質合成の研究を向上させる
研究者たちは、記憶研究におけるタンパク質合成分析を改善するためにDiDBiT-TMTを開発した。
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目次
タンパク質は私たちの体の中で重要な分子で、いろんな機能を持ってるんだ。これらのタンパク質がどうやって作られて、どんなシグナルに反応してその生産が変わるのかを理解することは、生物学の多くの分野、特に記憶や学習の研究にとって超重要だよ。最近の科学技術の進歩により、新しいタンパク質の形成をリアルタイムで追跡できるようになって、研究者たちはタンパク質が生物学的プロセスにどう関わっているかをよりよく理解できるようになったんだ。
その中で「BONCAT」っていう方法があって、新しく作られたタンパク質に特別なラベルをつけるんだ。このラベル付けによって、研究者たちはいろんな刺激に応じて生成されるタンパク質を視覚化して分析できるようになる。でも、BONCATには限界があって、結果の精度に影響を与えることもあるの。そこで「DiDBiT-TMT」っていう新しい方法が開発されて、いくつかの技術を組み合わせてタンパク質合成のよりクリアな pictureを提供するんだ。
タンパク質合成研究の重要性
タンパク質がどうやって作られるかを研究するのはすごく大事。なぜなら、タンパク質はほぼすべての生物学的機能に関与してるから。たとえば、新しいことを学ぶとき、私たちの脳はニューロン同士のつながりを形成したり強化したりするために新しいタンパク質を作る必要がある。このプロセスを「シナプス可塑性」って呼んでて、記憶形成にとって不可欠なんだ。こうしたプロセス中にタンパク質がどのように合成されるかを調べることで、科学者たちは私たちの脳の働きや記憶がどう形成されるかについての洞察を得られるんだ。
BONCAT技術
BONCAT技術では、タンパク質の構成要素である合成アミノ酸を使って、新たに合成されたタンパク質にラベルをつけるんだ。この合成アミノ酸、AHAって呼ばれてるものを生物システムに導入すると、タンパク質の形成中にそれが組み込まれる。タンパク質が生成されたら、研究者たちは特別な化学反応を使ってAHAラベルのついたタンパク質にビオチンという別のラベルを付けることができる。
その後、イメージング技術やウエスタンブロッティングみたいな方法を使って、科学者たちはこれらのラベルを付けたタンパク質を視覚化して定量化できる。これは、さまざまな実験条件に応じて生成される特定のタンパク質を特定するのに役立つから、すごく価値があるんだ。
BONCATの限界
BONCATは強力なツールだけど、限界もあるよ。たとえば、タンパク質がAHAでタグ付けされると、質量分析法で簡単に検出できないことがあるんだ。だから、研究者たちは結果を慎重に検証して、実験中に本当に合成されなかったタンパク質を間違って特定しないようにしないといけない。
さらに、伝統的なサンプルの濃縮方法は時々特定できない結果をもたらすことがあって、研究に関係ないタンパク質も最終分析に含まれることがある。これがデータの解釈を複雑にして、誤った結論につながることもある。
DiDBiT-TMTの導入
これらの限界に対処するために、科学者たちは「DiDBiT-TMT」っていう新しいアプローチを開発したんだ。この方法は、BONCATの利点を他の技術と組み合わせて、新たに合成されたタンパク質をより信頼性のある方法で研究できるようにしている。DiDBiT-TMTの主要な改善点は以下の通り。
前消化: 伝統的なBONCAT方法が洗浄用ビーズに付着した後にタンパク質を消化するのに対して、DiDBiT-TMTは付着する前にタンパク質を消化する。これにより、興味のあるタンパク質をより効果的に濃縮できて、不要なタンパク質が含まれる可能性が少なくなるんだ。
直接検出: DiDBiT-TMTでは分析段階でビオチンの修飾を直接検出できて、タンパク質特定の精度が向上する。
定量化とマルチプレクシング: この方法はTMTというラベル技術を使って、複数のサンプルを同時に比較できるようにしている。これにより、研究者たちは異なる条件からのタンパク質を一度の実験で分析できて、時間を節約できて結果の変動も減らせるんだ。
DiDBiT-TMTの応用
この研究では、DiDBiT-TMTを使って脳の学習と記憶に関する2つの重要なプロセス、長期増強(LTP)と、注意やストレス反応に関わる神経伝達物質のノルエピネフリンによるLTPの調節を調査したんだ。
目的は、これらのプロセスが記憶形成に重要かもしれないタンパク質の生産にどのように影響するのかを理解することだった。研究者たちはラボで培養した特定の脳組織を使用して実験を行い、タンパク質が生成される条件を制御できるようにしたんだ。
実験手順
組織型海馬スライス培養
実験では、若いラットから脳のスライスを作成した。スライスは生物体の条件を模した特別な溶液で培養される。約2週間の培養後、スライスは処理の準備が整った。研究者たちはニューロン同士の接続強度を持続的に高める長期増強を誘導しようとしたんだ。
長期増強の誘導
LTPを誘導するために、研究者たちはニューロンを刺激する特定の化学物質で脳スライスを処理したんだ。また、メチオニンというアミノ酸をスライスから除去する技術も使った。これは新たに合成されるタンパク質がAHAで正確にラベル付けされるのを保証するために必要だった。
処理の後、スライスは設定された時間AHAでインキュベートされて、タンパク質がラベル付けされる。その後、LTPが実際に誘導されたことを確認するために様々なテストが行われた。
ノルエピネフリンによる処理
研究者たちはノルエピネフリンがタンパク質合成にどのように影響するかも調べたかったんだ。AHAでラベル付けした後、スライスはノルエピネフリンで処理され、その後同じラベリングと分析のプロセスを行った。これによって、刺激に応じて生成されるタンパク質に対するノルエピネフリンの役割を探ることができたんだ。
DiDBiT-TMTプロトコル
DiDBiT-TMTプロトコルは、いくつかの重要なステップを含んでいた。まず、スライスは新たに合成されたタンパク質にラベルを付けるためにAHAで処理された。その後、ビオチンを付けるためのクリック反応や、タンパク質の抽出と消化が行われた。その後、分析に向けてサンプルがTMTでラベリングされた。
手順は、ラベル付けされたタンパク質が正確に濃縮され定量化されるように設計されていて、異なる条件下での新たに合成されたタンパク質の詳細な分析を可能にしたんだ。
ラベリングと濃縮
研究者たちは実験のさまざまな段階でタンパク質にラベルを付け、高容量のストレプトアビジンビーズを使ってビオチン化されたタンパク質を濃縮した。このステップが重要なのは、興味のあるタンパク質だけが質量分析段階で分析されることを保証するからなんだ。
質量分析による分析
タンパク質がラベル付けされて濃縮された後、質量分析を使用してその分析が行われた。これは、タンパク質を分離し、イオン化して、その質量を測定して特定するプロセス。結果から研究者たちは、各実験条件の下でどのタンパク質が生成され、どのようにその量が変わったかを確認できたんだ。
発見
実験を行った後、研究者たちはDiDBiT-TMTが脳スライス内で新たに合成されたタンパク質の大部分を特定できたことを確認した。特に、全タンパク質群と新規タンパク質群の中で、かなりの数のタンパク質が定量化されたんだ。
LTPにおける新たに合成されたタンパク質
LTPを誘導した後に得られたサンプルでは、複数のタンパク質が有意に調整されていることがわかった。たとえば、Ras-GRF1が最も上向きに調整されたタンパク質の一つとして浮かび上がり、LTPの過程での重要性を示唆している。その他にも、シナプス可塑性に関与することが知られているタンパク質が特定されていて、この方法が生物学的な要因を発見するのに効果的だったことを示してるんだ。
ノルエピネフリンの役割
同様に、ノルエピネフリンの影響を分析したとき、研究者たちはそれが多くのタンパク質を上向きに調整することにつながったこともわかった。ノルエピネフリンによって調整されたタンパク質とLTPによって調整されたタンパク質の重複はかなり大きくて、両方の要因が脳内で類似の経路に影響を与える可能性が高いことを示している。
重複するプロファイル
興味深い発見の一つは、ノルエピネフリンに応答して合成されたタンパク質とLTPの間での重複がかなり大きいことだった。これは、両方の処理によって活性化されるシグナル伝達経路が密接に関連していることを示唆していて、ノルエピネフリンがタンパク質合成に対するLTPの影響を強化する可能性があることを示してるんだ。
結論
DiDBiT-TMTの開発は、記憶や学習に関連するタンパク質合成の研究において重要な前進を示している。新たに合成されたタンパク質をラベル付けして定量化するための先進的な技術を組み合わせることで、研究者たちはこれらのタンパク質が脳の中でどのように機能するかについてより深い洞察を得ることができるようになったんだ。
この研究からの発見は、シナプス可塑性や記憶形成の根底にある分子メカニズムに関する貴重な情報を提供している。この新しいアプローチによって、科学者たちはさまざまな刺激に応じてタンパク質生産がどのように影響されるかをさらに探求することができる。
要するに、DiDBiT-TMTは神経生物学やその他の分野での研究に新しい道を開いて、タンパク質が生物学的プロセスにどのように貢献するかの効果的な調査を可能にする有望な方法なんだ。このアプローチは、記憶や学習メカニズムの理解を深める可能性があって、最終的には心理学、教育、医学などの分野に利益をもたらすかもしれないんだよ。
タイトル: WITHDRAWN: DiDBiT-TMT: A novel method to quantify changes in the proteomic landscape induced by neural plasticity
概要: Withdrawal StatementThe authors have withdrawn this manuscript because during the peer review process in the journal, it was discovered that one of the processed proteomic data groups (the chemical LTP group) was mistakenly processed from the raw data for the norepinephrine group, resulting in an apparent complete overlap between the two conditions. For a correct analysis, please refer to the currently published peer-reviewed publication through the following DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.4c00180 Therefore, the authors do not wish this preprint to be cited as reference for the project. If you have any questions, please contact the corresponding author.
著者: John Robert Yates III, M. Gamaleldin, N.-K. Yu, J. Diedrich, Y. Ma, A. Wienand, D. McClatchy, A. Nykjaer, S. Nabavi, J. R. Yates
最終更新: 2024-10-09 00:00:00
言語: English
ソースURL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.07.583889
ソースPDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.07.583889.full.pdf
ライセンス: https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
変更点: この要約はAIの助けを借りて作成されており、不正確な場合があります。正確な情報については、ここにリンクされている元のソース文書を参照してください。
オープンアクセスの相互運用性を利用させていただいた biorxiv に感謝します。