mRNAにおけるm6Am修飾の新しい知見

修飾ヌクレオチドは、細胞でタンパク質を作るための遺伝情報を運ぶmRNAの機能において重要な役割を果たしている。その中で、mRNAで最も一般的な修飾ヌクレオチドの一つがm6Am（N6,2’-O-ジメチルアデノシン）だ。この特別な修飾は、mRNAの最初の部分、いわゆる転写開始ヌクレオチド（TSN）に見られる。TSNは、転写が始まるDNAの位置に対応している。

遺伝子がmRNAに転写されるとき、TSNには通常、2’-O-メチル修飾と呼ばれる修飾が加えられる。この変更はCMTR1という酵素によって追加される。もしTSNがアデノシンの場合、さらにPCIF1という別の酵素がメチル基を追加することでm6Amが生成される。

研究によると、m6Amは細胞の機能にとって重要だ。例えば、普通の細胞はPCIF1が欠けていても成長が遅くならないけど、酸化ストレス下ではPCIF1がないと細胞の成長が妨げられる。癌細胞では、特定の治療中にPCIF1がないと細胞死率が高くなることがある。また、ウイルス感染時には、PCIF1の枯渇がHIVの複製を増やしたり他のウイルスにも影響を与えることがある。

m6Amの重要性から、科学者たちはこの修飾を含むmRNAを特定して研究しようとしている。初期の研究では、mRNAはm6Am型またはAm（2’-O-メチルアデノシン）型のどちらかで存在することができ、Amの方が一般的だとされていた。m6Am修飾を持つ遺伝子を特定するために、いくつかの方法が開発されてきた。しかし、さまざまな転写体にわたるこれらの修飾をマッピングする多くの研究にも関わらず、m6AmがmRNAに与える正確な影響は不明なままだ。

#m6Amを理解する上での課題

m6Amを理解する上での主な課題の一つは、遺伝子の特性付けの仕方にある。以前のマッピング研究では、m6Amを他のmRNA内の修飾ヌクレオチドと同じように機能するかのように扱っていた。しかし、m6Amは転写の最初に位置しているため、遺伝子の表現の仕方によって影響を受け、さまざまな転写アイソフォームが異なるポイントから始まることになる。つまり、多くの遺伝子には単一の開始ヌクレオチドがなく、以前の研究に基づいて特定の修飾状態を割り当てることが難しいということだ。

さらに、これらの研究では、各遺伝子をm6Amを持つか持たないかに分類していた。この二元的な分類は、一部の転写物がm6Amの異なるレベルを持つ可能性を考慮していない。これにより、m6Amの役割について誤った結論が導かれることがある。

また、m6Amはスプライシングに関与する小核RNA（snRNA）にも広く存在することに注意する価値がある。当初は、ほとんどのsnRNAがAmから始まると考えられていた。しかし、後の研究では、相当数のsnRNAもm6Amを含むことが明らかになり、これは別の酵素FTOによってAmに脱メチル化される。

#CROWN-seq：m6Amをマッピングするための新しい方法

m6Amの分布と影響をよりよく理解するために、研究者たちはCROWN-seqと呼ばれる新しい方法を開発した。この技術は、科学者がすべての5’転写アイソフォームのTSNを正確にマッピングし、それらのサイトに存在するm6Amのレベルを定量化できるようにする。

CROWN-seqは、mRNAの末端を選択的に分析することでTSNからの信号を濃縮するため、ユニークだ。CROWN-seq中に、化学処理によってAmが別の形に変わり、研究者はTSNがm6Amとして修飾されているかAmのままであるかを判断できる。これは、m7Gキャップされた転写物を分離し、さまざまな細胞タイプにわたる各開始サイトで存在するm6Amのレベルを定量化することで行われる。

CROWN-seqの結果、遺伝子間でTSNの多様性が非常に多いことが明らかになり、単一の転写開始ヌクレオチドで正確に特性付けられない遺伝子が多く存在することが示された。この研究によると、ほとんどすべてのA開始の転写アイソフォームは高いm6Amストイキオメトリーを持っており、これらの場合ではm6Amが転写の開始部分で優勢な形であることが分かった。

#m6Amの分布とレベルに関する発見

CROWN-seq法では、219,195のTSNが特定され、そのうち92,278が複数のヒト細胞株にわたってA-TSNとして特定された。この広範なマッピングは、mRNAにおけるm6Amの高い存在を示しており、以前の不正確な方法に基づく仮定とは対照的だ。

データによると、m6Amは遺伝子発現の高いレベルに関連していることが示唆されており、m6Amで始まる転写物は以前に認識されていたよりも頻繁に現れる。m6Amのレベルの変化は、異なる転写メカニズム間で顕著に異なっていた。特に、遺伝子のプロモーター領域の特定のモチーフはm6Amレベルと相関しており、m6Amの存在が転写を促進する可能性を示唆している。

#m6Amと転写の関係

研究からの興味深い発見の一つは、m6Amと転写活性の直接的な関連性だ。転写物のm6Amストイキオメトリーが高いほど、遺伝子発現のレベルが一般的に増加していた。この関係は、m6AmがmRNAの安定化因子として機能するのか、それとも転写開始プロセスに特有の役割を持つのかについて疑問を投げかける。

研究では、m6Amレベルが高いA-TSNは酵素PCIF1をノックアウトすると発現が大幅に減少したのに対し、m6Amレベルが低いA-TSNは発現にほとんど変化が見られなかった。これは、特定のプロモーターモチーフに関与する転写メカニズムに対してm6Amが潜在的に依存していることを示唆している。

#さまざまな細胞タイプにおける観察

研究者たちは、9つの異なる細胞株にわたってm6Amストイキオメトリーを調査し、全体的に高いレベルを観察した。PCIF1の発現はm6Amレベルとある程度相関していたが、PCIF1の発現が低い細胞株でも依然として高いm6Amストイキオメトリーを示した。この観察は、PCIF1以外の要因がmRNAにおけるm6Amの調整に寄与している可能性を示唆している。

mRNAに加え、CROWN-seqはsnRNAとsnoRNAにおけるm6Amレベルも定量化した。興味深いことに、結果はsnRNAがmRNAに比べて一般的にm6Am修飾のレベルが低く、異なる細胞株間での変動が大きいことを示した。

#m6Am調整におけるFTOの役割

研究結果は、m6Amを脱メチル化する酵素FTOがsnRNAとsnoRNAにおけるm6Amレベルの制御において重要な役割を果たしていることを強調している。この研究は、FTOの発現がm6Amレベルと負の相関を持っていることを示しており、つまりFTOのレベルが高いほどm6Amが低くなることを意味する。FTOをノックアウトすると、snRNAにおけるm6Amレベルが大幅に増加し、FTOが主要な調整因子であることを示している。

FTOはsnRNAでは重要な役割を果たすが、mRNAにおけるm6Amへの影響は最小限であり、m6Amがこれらの2種類のRNAで異なるメカニズムによって調整される可能性が示唆されている。

#結論：mRNAにおけるm6Amに対する新しい視点

CROWN-seqの導入によって、mRNAにおけるm6Amの全体像がより明確になった。以前の研究は、遺伝子が単一のTSNで表されるという考えに heavily reliedしていたため、m6Amをマッピングする際に潜在的な不正確さがあった。CROWN-seqは、すべての開始サイトをマッピングし、m6Amのレベルを定量的に測定することで、これらの問題に対処している。

研究は、m6Amが安定性よりも転写開始において重要であることを強調している。m6Amの転写物の豊富さとの相関は、m6Amがコアプロモーター配列に導かれた転写メカニズムに関連する特定の調整的役割を果たす可能性があることを示唆している。

今後、m6Amの機能やさまざまな細胞経路との相互作用を完全に探るためのさらなる研究が必要だ。m6Amと転写開始の関係は、すべての細胞における遺伝子調節と発現の理解に深い影響を与えるかもしれない。