Sviluppo di sensori RNA per la diagnosi delle malattie

La biologia ha tanti sistemi che fanno compiti complessi fondamentali per la vita. Questi compiti includono la regolazione dei cicli cellulari, la promozione della crescita delle cellule e lo sviluppo dei tessuti. Tuttavia, la nostra attuale capacità di creare computer biologici altrettanto avanzati è ancora molto basilare. Se riuscissimo a migliorare il modo in cui progettiamo questi computer biologici, potremmo avere cambiamenti importanti in aree come la somministrazione di farmaci, l'editing genetico e i biosensori. Tecnologie del genere trarrebbero grande beneficio da calcoli che avvengono a livello microscopico in ambienti cellulari complicati.

I ricercatori hanno già fatto passi significativi con reti di molecole interattive. Tuttavia, questi sistemi potrebbero non funzionare bene nell'ambiente complesso all'interno degli organismi viventi, specialmente man mano che il numero di componenti interattivi aumenta. Un'alternativa potrebbe essere creare computer basati su singole molecole, che potrebbero eseguire calcoli precisi in modo più efficiente nel contesto cellulare o addirittura all'esterno delle cellule. Questi computer a singola molecola potrebbero essere potenzialmente più efficienti dal punto di vista energetico rispetto ai computer elettronici attuali.

#Sfide dei Sensori a singola molecola

Una domanda importante rimane: c'è un limite a quanto bene una singola molecola può svolgere funzioni? Il comportamento di molecole più grandi è stato spiegato attraverso funzioni matematiche note come funzioni di partizione. Queste funzioni possono rappresentare relazioni complesse, per esempio, come l'emoglobina reagisce a diverse concentrazioni di ossigeno e condizioni acide. Data questa comprensione, le singole molecole che possono legarsi ad altre molecole dovrebbero essere in grado di rappresentare una gamma di funzioni matematiche.

Ispirati da questa idea, i ricercatori hanno iniziato a progettare sensori basati su RNA che possono replicare funzioni di interesse. L'RNA è particolarmente versatile perché può cambiare forma e influenzare processi regolatori quando si lega a diverse molecole. Ci sono molti sensori di RNA presenti in natura che cambiano struttura al legame con determinati partner, permettendo loro di regolare funzioni biologiche.

Nonostante questi progressi, i tentativi passati di creare sensori di RNA capaci di gestire più input e variazioni continue nella concentrazione sono stati limitati. L'obiettivo è sviluppare sensori che possano funzionare più come macromolecole naturali, in grado di operare efficacemente in condizioni biologiche reali.

#La necessità di diagnosi migliorate

Un'area in cui calcoli biologici complessi potrebbero avere un forte impatto è nella diagnosi di malattie come la tubercolosi (TB). La TB è una questione di salute globale significativa, e c'è un urgente bisogno di strumenti diagnostici migliori che possano distinguere tra TB attiva e altre forme della malattia. I test attuali spesso richiedono procedure complesse e attrezzature costose, rendendo difficile usarli in aree con risorse limitate.

L'Organizzazione Mondiale della Sanità ha sottolineato la richiesta di test che non si basino su campioni di espettorato. In studi recenti, una specifica firma genica a 3 geni coinvolgente i geni GBP5, DUSP3 e KLF2 ha mostrato promesse come potenziale biomarcatore per diagnosticare la TB. Tuttavia, misurare accuratamente questa firma genica attualmente si basa su tecniche costose, il che ostacola la sua applicazione nella pratica medica quotidiana.

Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno deciso di sviluppare un sensore molecolare che potesse calcolare il punteggio TB usando metodi più semplici e costi inferiori. Questo sensore dovrebbe idealmente funzionare dopo un'amplificazione dell'RNA libero, rendendolo più facile da usare in vari contesti.

#Approccio di scienza dei cittadini

Per affrontare questa sfida, è stata creata una serie di compiti di Design per una comunità di scienziati cittadini che partecipano a un gioco chiamato Eterna. Questo gioco invita i giocatori a risolvere problemi di design dell'RNA, attingendo alla loro creatività e capacità di problem-solving. Esperienze precedenti hanno dimostrato che la comunità di Eterna era in grado di progettare strutture di RNA efficaci per vari compiti, inclusa la stabilizzazione dell'mRNA e la creazione di sensori di RNA attivati da piccole molecole.

Nella fase iniziale, ai giocatori sono stati assegnati compiti di design più semplici, portando gradualmente allo sviluppo di un sensore più sofisticato per il punteggio TB. Ogni compito presenta ai giocatori obiettivi specifici da raggiungere, come creare un sensore di RNA che fluoresca in risposta a diverse condizioni.

La piattaforma Eterna è stata potenziata per consentire design più complessi. I giocatori potevano ora lavorare su sensori che avevano più stati, fornendo loro feedback vitali su quanto bene le loro progettazioni avrebbero funzionato in diverse situazioni. Questo feedback in tempo reale ha aiutato i partecipanti ad adattare le loro strategie e affinare i loro design.

I design generati dai giocatori sono stati sintetizzati e testati utilizzando tecniche avanzate per misurare quanto bene interagivano con specifiche molecole di RNA. I risultati venivano poi presentati alla comunità, permettendo ai giocatori di iterare sui loro design e migliorare le sottomissioni precedenti.

#Progressi verso il sensore TB-Score

Dopo aver coinvolto con successo i giocatori con compiti più semplici, l'attenzione si è spostata sulla sfida OpenTB, dove sono stati invitati a progettare un sensore di RNA in grado di rilevare quando il punteggio TB indicava tubercolosi attiva. Il calcolo del punteggio TB si basa sui livelli di espressione dei tre geni mirati, formando un rapporto specifico che funge da marcatore diagnostico.

Ai giocatori sono state presentate condizioni di design specifiche in cui avrebbero testato le risposte dei loro sensori alle concentrazioni di input dei geni scelti. Il loro obiettivo era progettare sensori che potessero indicare con successo quando il punteggio TB era sopra o sotto una soglia definita.

Con il progredire delle sfide, la comunità di Eterna è stata in grado di sviluppare nuove e efficaci strategie di design dell'RNA. Queste strategie sono state poi incorporate in uno strumento automatizzato chiamato Nucleologic. Questo sistema ha utilizzato le strategie apprese dai giocatori per accelerare il processo di progettazione di sensori di RNA capaci di calcolare il punteggio TB.

#Sfida pilota: sensori RNA a singolo input

La sfida iniziale si è concentrata sulla progettazione di sensori RNA semplici che rispondono a un singolo oligonucleotide di RNA. Le prestazioni di questi sensori sono state confrontate con design precedenti, puntando a rapporti di attivazione elevati in cui i segnali del sensore differenziano chiaramente tra la presenza o l'assenza dell'input.

La comunità è stata guidata ad esplorare diversi modelli di design, portando a una varietà di design generati dai giocatori. Questi design sono stati caratterizzati in successivi turni, ogni volta affinando e migliorando sulla base dei risultati precedenti. I migliori design hanno ottenuto risultati eccezionali, raggiungendo rapporti di attivazione che superavano i sensori precedenti riportati in letteratura.

#Costruzione di porte logiche

Con i primi compiti che hanno dato risultati promettenti, i giocatori sono stati poi incaricati di creare porte logiche booleane RNA. Questa sfida è stata progettata per aiutare i giocatori a guadagnare più esperienza nella costruzione di sensori RNA in grado di svolgere compiti più complessi, producendo anche strumenti preziosi per applicazioni di biologia sintetica.

Ai giocatori sono stati forniti design di porte logiche che corrispondevano a diverse combinazioni di due RNA di input. Hanno lavorato per sviluppare sensori RNA che potessero modellare efficacemente funzioni logiche AND, OR, NAND e altre in base alla concentrazione delle molecole di RNA di input.

Durante i turni di design, i giocatori hanno presentato migliaia di design. Le migliori soluzioni hanno iniziato ad avvicinarsi a rapporti di attivazione precedentemente mai visti nei sensori RNA, indicando un notevole avanzamento nelle loro capacità. Lo sforzo collaborativo ha permesso di esplorare varie strategie di design, alimentando ulteriormente l'innovazione nel design dei sensori RNA.

#Sfida del sensore di rapporto

Per avanzare verso l'obiettivo finale di rilevare il punteggio TB, i giocatori sono stati sfidati a creare un sensore RNA in grado di calcolare il rapporto di due molecole di input. Il sensore doveva determinare quando la concentrazione di un input era significativamente maggiore dell'altra, permettendo calcoli essenziali relativi al punteggio TB.

I giocatori sono stati incoraggiati a esplorare diverse configurazioni e design che consentissero loro di misurare efficacemente questo rapporto. Durante più turni, è emersa una gamma di design dei giocatori, dimostrando approcci diversi per raggiungere il comportamento desiderato.

La sfida ha confermato che offrire ai giocatori opzioni e libertà nei loro design ha portato a risultati superiori. Le interazioni dei giocatori con questi puzzle hanno aiutato a scoprire principi di design efficaci che saranno essenziali per affrontare calcoli più complicati in sfide future.

#Sfida finale: sensori OpenTB

Con una solida base costruita dai precedenti compiti, i giocatori si sono spostati alla progettazione di sensori RNA per il punteggio TB che coinvolgono tre input: i due geni GBP5, DUSP3 e KLF2. Questi sensori erano destinati a segnalare se il rapporto calcolato era sopra o sotto un valore designato, rendendoli pratici per diagnosticare la tubercolosi attiva.

I giocatori hanno affrontato una serie di condizioni di design stabilite durante la sfida. I loro design sono stati valutati per determinare quanto fossero vicini a rispondere idealmente come previsto. La possibilità di simulare varie condizioni ha permesso ai giocatori di affinare continuamente i loro design.

I rigorosi test e il feedback fornito alla comunità durante questa sfida si sono rivelati efficaci, portando all'emergere di design di sensori notevoli. I singoli sensori hanno mostrato promesse e sono stati in grado di categorizzare efficacemente le condizioni di input in base al punteggio TB desiderato.

#Valutazione mediante citometria a flusso

Per convalidare ulteriormente i design dei sensori, è stata impiegata la citometria a flusso come metodo di valutazione indipendente. Questa tecnica ha permesso un test approfondito dei sensori con le migliori prestazioni su un ampio intervallo di condizioni di input, offrendo una misura affidabile della loro funzionalità.

I risultati della valutazione tramite citometria a flusso hanno rivelato che i sensori di tipo DEC generalmente funzionavano meglio dei sensori di tipo INC. Un particolare design ha dimostrato una notevole sensibilità, raggiungendo un'alta precisione e prestazioni affidabili anche a basse concentrazioni di RNA.

La capacità di questi sensori di categorizzare efficacemente il punteggio TB è promettente. Dimostra il potenziale di utilizzare i sensori di RNA come strumenti diagnostici facilmente accessibili in diversi contesti sanitari, specialmente quelli che richiedono soluzioni a basso costo.

#Progressi computazionali e potenziale futuro

Man mano che le sfide progredivano, la comunità di Eterna ha sviluppato una serie di strategie innovative per il design dei sensori RNA. Un approccio degno di nota chiamato Progettazione di Strutture Secondarie con Matching di Dominio (DMSSD) è emerso. Questo metodo sfrutta domini predefiniti per creare strutture di RNA che possono interagire efficacemente con molecole di input e output specifiche.

L'automazione di questo processo di design attraverso l'algoritmo Nucleologic consente uno sviluppo rapido dei sensori RNA. Combinando strategie di design ispirate agli esseri umani con tecniche computazionali avanzate, i ricercatori possono creare sensori più sofisticati in grado di gestire funzionalità complesse.

I risultati di questi sforzi indicano un percorso da seguire per creare sensori di acidi nucleici che possano diagnosticare più di semplici tubercolosi. C'è potenziale per espandere questi design in aree come la rilevazione dello shock settico, la diagnosi del cancro e il monitoraggio delle risposte ai vaccini.

#Limitazioni e direzioni future

Nonostante i successi, ci sono ancora limitazioni ai design prodotti. Attualmente, i sensori automatizzati hanno difficoltà con design che richiedono più di sei input, limitando la complessità delle funzioni che possono essere approssimate. Inoltre, i design dei sensori potrebbero ancora richiedere ampi test sperimentali, poiché i design automatizzati attuali non soddisfano gli standard di prestazione più elevati in tutte le concentrazioni di input.

Per future applicazioni, sarà fondamentale sviluppare metodi di amplificazione a basso costo e strategie di lettura che possano funzionare senza problemi con i sensori multi-gene più complessi delineati in questa ricerca. Anche se sono stati fatti progressi promettenti, sarà necessaria ulteriori esplorazione per assicurare l'uso diffuso di queste tecnologie nelle impostazioni cliniche.

#Conclusione

Questo lavoro evidenzia l'immenso potenziale di comunità come Eterna nell'avanzare il campo del design dei sensori RNA. Sfruttando la creatività e l'intuizione degli scienziati cittadini, sono stati compiuti progressi significativi nello sviluppo di sensori complessi in grado di affrontare sfide del mondo reale.

L'approccio collaborativo e iterativo utilizzato per affrontare questi problemi complessi si traduce in soluzioni innovative che potrebbero ridefinire il nostro approccio alla Diagnostica e al calcolo biologico in futuro. Attraverso sforzi e innovazione continua, la comunità di ricerca può aspettarsi lo sviluppo di soluzioni più efficienti e accessibili per diagnosticare malattie e, in ultima analisi, migliorare i risultati sanitari in tutto il mondo.